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26S蛋白酶体降解途径在植物正常生长发育和胁迫应答以及激素反应中都起到很重要的作用。近年来关于这些方面的研究取得了很大进展。内质网胁迫与逆境胁迫的关系是目前植物研究中的一个新兴课题。内质网介导的蛋白降解(ERAD)是26S蛋白酶体降解途径的一个重要方面,同时也是生物应对内质网胁迫的一个重要手段。研究内质网介导的蛋白降解对了解内质网胁迫与逆境胁迫应答之间的关系具有非常重要的作用。到目前为止植物中对内质网介导的蛋白降解的研究还很少。本论文通过生物化学、分子生物学、细胞生物学以及遗传学的方法对拟南芥泛素结合酶UBC32的生化功能、参与的生理过程以及在内质网介导的蛋白降解信号转导中的作用进行了系统的分析和全面的阐述。
通过基因芯片分析,发现了一个受多种非生物胁迫诱导的拟南芥泛素结合酶基因UBC32；RT-PCR、Rea1-Time PCR和Promoter-GUS染色分析表明这个基因普遍表达于各个组织,并受高盐、干旱、ABA、渗透胁迫和内质网胁迫诱导剂的诱导。通过在转基因拟南芥中稳定表达UBC32-GFP融合蛋白和细胞器染色进行亚细胞定位研究,发现 UBC32位于内质网膜上。体外泛素化实验证明UBC32是一个有功能的泛素结合酶。通过对UBC32 T-DNA插入突变体植株、野生型以及过表达转基因植株的比较,发现它们对盐胁迫和内质网胁迫的反应发生了变化,同时也改变了内质网胁迫相关响应基因的表达。其中UBC32过表达植物与野生型和突变体相比,它对高盐和内质网胁迫更敏感,在高盐平板上表现为真叶变黄甚至白化的比例最高,在衣霉素平板上它的子叶变绿和真叶萌出被抑制。在正常生长条件下野生型、突变体和UBC32过表达转基因植物相比,UBC32过表达转基因植物中内质网内分子伴侣的表达量降低,突变体表达量最高；而在内质网胁迫诱导剂衣霉素处理条件下,过表达植物中内质网分子伴侣的表达量最高,突变体最低。烟草叶片瞬时表达实验证明UBC32参与已知ERAD底物MLO-12蛋白的降解。遗传互补实验表明,UBC32基因突变可以使另一个植物中已知的ERAD底物bril-5突变体的生长矮小、叶子卷曲等表型部分恢复。由以上实验推断,UBC32通过参与内质网介导的蛋白降解来影响内质网胁迫应答,进而影响植物对逆境的胁迫应答反应。