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肿瘤是严重威胁人类健康的主要疾病之一。其中原发性肝癌是我国第二位的癌症杀手。我国每年因肝癌而死亡的人数有12万之多,占全球肝癌死亡数的44%左右。高侵袭和高转移是肝癌致死的主要原因。在肝癌的侵袭和转移过程中,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解是肿瘤侵袭和转移的一个关键环节。其中,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)在ECM的降解过程中发挥重要作用。近年研究发现,MMPs的产生受HAb18G/CD147分子的调节。HAb18G/CD147分子在多种肿瘤细胞呈高表达,并通过刺激周围成纤维细胞产生MMPs降解细胞外基质,促进肿瘤细胞的浸润和转移,因而对该分子功能的研究已成为肿瘤生物学又一个研究热点[1, 2]。然而,HAb18G/CD147分子介导肿瘤细胞与成纤维细胞间通讯的作用分子还不清楚,其分子受体不明确。因此本研究拟引入新发现的哺乳动物细胞蛋白质与蛋白质相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系统,以HAb18G/CD147胞外片段(HAb18G extracellular portion, HAb18GEP)为“诱饵”,用多种组织来源的膜/分泌蛋白为“猎物”,进行HAb18G/CD147相互作用分子的初步筛选工作。为进一步探讨该分子在肝癌转移中的作用机制及其介导的多种生物学功能研究奠定基础。本实验共分四个部分:第一部分:EpoR/LR-F3/HAb18GEP嵌合受体的构建及其在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达。用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因,Sac I/Not I双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中,构建EpoR/LR-F3/HAb18GEP嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEP,并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体(按1:9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞,用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEP cDNA的细胞克隆(4周)。用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验,检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEP嵌合受体的表达。结果表明: EpoR/LR-F3/HAb18GEP嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEP构建成功,经测序验证插入序列正确。将重组表达载体和POG44载体共转染HEK293-16工程细胞后,经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEP的稳定株,其表达EpoR的阳性率为99.93%,平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)为1036.39,表达HAb18GEP的阳性率为99.51%,MFI为652.72,且可被Zeocin致死。以上结果表明,本实验成功地建立了定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEP嵌合受体的HEK293-16工程细胞株。第二部分:融合gp130片段的膜/分泌蛋白逆转录病毒cDNA文库的构建。将购自BD公司的20种组织的总RNA反转录合成cDNA,用设计的11对膜/分泌蛋白(membrane and secreted proteins, MSPs)基因特异性引物进行PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及紫外分光光度法定量后等比例混合,1%琼脂糖凝胶电泳后纯化、定量。再经EcoR I和Not I双酶切后纯化、定量,建立连接反应体系,克隆入逆转录病毒pBG1载体gp130后的相应酶切位点,转化宿主菌。用菌液PCR、双酶切及随机克隆测序方法对构建的细菌形式MSPs-cDNA文库的多样性进行全面鉴定。提取PBG1/MSPs-cDNA文库质粒,用LipofectamineTM 2000脂质体转染Plat-E逆转录病毒包装细胞,同时以混合质粒(PBG1/MSPs-cDNA文库质粒和PBG1/EGFP质粒等比例混合)转染Plat-E细胞为对照。转染48h后取文库质粒转染后的Plat-E细胞的培养上清,滴网、电镜观察病毒包装是否成功。以混合质粒转染的Plat-E细胞培养上清倍比稀释,感染HEK293-16细胞。以流式细胞术检测HEK293-16细胞EGFP表达情况,估算病毒滴度。以上结果证实,细菌形式MSPs-cDNA文库重组率高,MSPs cDNA所占比例高达43%,比常规cDNA文库中MSPs所占百分比提高了约33%。经Plat-E细胞包装出的病毒滴度为5.73×106/ml。以上实验结果均提示:成功构建和包装了多种组织来源富含MSPs的逆转录病毒cDNA文库。第三部分:MAPPIT系统“信噪比”的控制。分别铺种EPO/LR/HAb18GEP/HEK293-16细胞和HEK293-16细胞于75cm2培养瓶中,各铺种4瓶,每瓶1.5×106细胞,加入Epo,终浓度为5 ng/ml。24h后分别补加嘌呤霉素至终浓度0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml,每周换液一次并保持Epo和嘌呤霉素浓度,三周后镜检克隆形成数目确定Epo和嘌呤霉素浓度(每瓶克隆1～2个常规大小克隆,或数个小克隆)。经分析“信噪比”控制实验结果,最终确定后续的HAb18G/CD147相互作用分子筛选条件为:Epo终浓度为5 ng/ml和嘌呤霉素终浓度为1μg/ml。第四部分:HAb18G/CD147相互作用分子的初步筛选。利用构建的富含MSPs的逆转录病毒cDNA文库病毒感染表达嵌合受体的HEK293-16细胞,在Epo终浓度为5ng/ml和嘌呤霉素终浓度为1μg/ml筛选条件下,连续加压筛选三周后获得10个细胞克隆。提取总RNA后,经反转录、PCR扩增出HAb18G/CD147分子的候选相互作用分子基因,连接入pMD18-T载体测序,初步筛选获得6个候选的相互作用分子基因序列。结果表明:运用MAPPIT系统初步筛选得到6个HAb18G/CD147潜在的相互作用分子,为寻找HAb18G/CD147分子的作用受体提供了新的思路。