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猪细小病毒(Porcine Parvovims, PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2, PCV2)引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的系列疾病。该两种疾病在世界范围内广泛流行,造成了巨大的经济损失,目前,对这两种疾病的防制主要靠预防接种。然而,目前广泛使用的猪细小病毒灭活疫苗存在灭活不完全的风险,而且由于PPV体外培养较困难,病毒增殖滴度较低,这给灭活疫苗的生产带来一定困难；同时PCV2在细胞上增殖滴度很低,发展传统疫苗都存在一定障碍,因此有必要发展新型疫苗来防制这两种疾病。这两种疾病常发生混合感染,并具有协同性,如果能研发一种可同时预防这两种疾病的疫苗,将具有重要意义。据此,本研究展开了对四川省PPV和PCV2的抗原流行病学调查,以掌握其流行现状；对PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因及其串联基因设计核酸疫苗；并以猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)为活病毒载体,构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗,为进一步预防和控制PRV、PPV和PCV2及其混合感染打下坚实的基础。具体如下：1.四川省猪细小病毒、猪圆环病毒2型流行病学调查从四川省21个规模化猪场共采集273份样品,通过PCR诊断技术进行了PPV、PCV2病原流行病学调查,结果检出PPV抗原阳性样品47份(17.22%)、PPV阳性猪场8个(38.1%),具有种猪的感染率较高,而在仔猪感染率相对较低的特点：检出PCV2抗原阳性样品143份(52.38%)、PCV2阳性猪场18个(85.7%),具有PCV2感染随猪年龄的增长而升高的趋势；检出PPV和PCV2混合感染样品29份(10.62%)、同时混合感染PPV和PCV2的猪场6个(28.7%),混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。2.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建通过PCR方法扩增PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因,并分别插入真核表达载体pCI-neo中,成功构建了真核表达质粒pCI-VP2和pCI-ORF2,同时,将PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因进行串联,两基因间以高亲水性氨基酸(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸连接,插入到PCI-neo中构建真核表达质粒pCI-VP2-ORF2。将pCI-VP2. pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2转染Vero细胞后,通过RT-PCR法检测目的基因转录、SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析蛋白表达,结果表明,3种真核表达质粒转染哺乳动物细胞后,既可扩增到目的基因,也可检测到特异性蛋白的表达,成功地表达了外源基因。3.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗对小鼠免疫效果研究将84核酸疫苗pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2以100μg/只剂量免疫健康昆明小白鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,于首免后O d、7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d断尾采血并分离血清进行抗体检测,发现首免后14d,可检测到PPV和PCV2特异性抗体的出现,加强免疫后7d,其抗体转化为阳性,但其诱导抗体水平均低于疫苗组所诱导的抗体水平：于首免后0 d、21 d、56 d分离血清进行细胞因子检测,发现其均可诱导较高水平的IL-2、IL-4、IFN-y;于首免后56d,采集抗凝血一份,进行T淋巴细胞亚群检测,发现CD4+/CD8+比例明显下降；首免后56d在每组随机挑选一只小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏制备单个脾细胞悬液,用ConA进行刺激并测定刺激指数,发现能够诱导较强的脾细胞增殖；首免后56d采集小鼠的实质器官,进行安全性检测,均未检测到3种核酸疫苗的外源基因与小鼠基因组DNA整合的情况,表明3种核酸疫苗是安全的。这些结果说明,3种核酸疫苗均能够诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有良好的安全性。4. PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建将VP2-ORF2融合基因从真核表达载体pCI-VP2-ORF2切下,连接到PRV通用转移载体pPI-2.EGFP中,成功构建了转移载体pPI-2.EGFP-VP2-ORF2。将PRV SA215基因组DNA与转移质粒pPI-2.EGFP-VP2-ORF2共转染Vero细胞,通过同源重组,构建重组病毒。挑斑筛选后,通过绿色荧光检测和PCR检测表明成功构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗株PRV SA215 (Dl);通过SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析,结果表明,VP2基因和ORF2基因在重组PRV SA215 (D1)获得了成功表达,融合蛋白具有良好的免疫反应原性。5. PRV SA215(D1)部分生物学特性研究将PRV SA215(D1)接种Vero细胞,观察其致病变效应、重组病毒的形态,测定一步法生长曲线,结果表明,外源PPV VP2和PCV2 ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖和病毒粒子的包装。将PRVSA215(D1)在Vero细胞上连续传6代,未发现PPV VP2和PCV2 ORF2基因丢失,表明PRV SA215(D1)具有遗传稳定性。将PRVSA215(D1)以104PFU剂量免疫健康昆明小鼠,发现其对小鼠有良好的安全性,以104PFU免疫小白鼠可对106 PFU PRV Fa株强毒攻击产生完全保护。将PRVSA215(D1)以105PFU剂量免疫仔猪,可引起仔猪外周血CD4+T淋巴细胞阳性细胞数明显提高,CD8+T淋巴细胞阳性细胞数相对减少；可诱导产生较高水平的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,表明能够显著的增强Thl和Th2型免疫应答；可诱导仔猪产生较高水平的PRV、PPV和PCV2的抗体,其中PRV水平抗体与其亲本株PRV SA215相当,PPV和PCV2抗体水平略低于灭活疫苗组;这些结果表明,PRV SA215(D1)可望作为预防控制PRV、PPV和PCV2的三价基因工程疫苗候选株。