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增殖型腺病毒又称条件复制型腺病毒或溶瘤病毒,可利用肿瘤与正常组织细胞间结构及代谢途径的差异,靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖,最终裂解肿瘤细胞,同时能长效表达抗肿瘤的外源基因。常用的5型增殖型腺病毒具有可复制、体积小、弥散能力强等优点,但也存在感染效率不高及毒副作用强等问题。人35型腺病毒（Ad35）属于B2亚群,与传统的5型等C组腺病毒载体相比有许多优点:血清中的中和抗体阳性率较低;与5型腺病毒（Ad5）无免疫交叉反应;感染细胞不依赖CAR受体,能够高效感染多种重要的干细胞及原代肿瘤细胞;肝脏毒性低,免疫副作用小等。用35血清型腺病毒的纤毛蛋白的knob和shaft替换传统5型腺病毒载体纤毛蛋白的knob和shaft,构建具有嵌合型纤毛蛋白的Ad5/F35腺病毒。此类Ad5/F35腺病毒载体继承了Ad35的感染特性,能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞,尤其是对肿瘤细胞及造血干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率。研究表明,在感染肿瘤细胞及造血干细胞等细胞时,Ad5/F35嵌合增殖型腺病毒载体是比5型增殖型腺病毒更高效的转基因载体,在胃癌等恶性肿瘤的基因治疗中具有良好前景。TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,又称凋亡素2配体（Apo2 ligand,Apo2L）,是TNF家族重要的促凋亡分子。肿瘤的发生发展取决于多种促凋亡基因与抑凋亡基因的体内平衡,而TRAIL作为一种选择性胞浆毒素蛋白,能够选择性诱导胃癌等多种肿瘤细胞凋亡。有研究者利用5型增殖型腺病毒载体携带TRAIL基因,构建了腺病毒ZD55-TRAIL并用于治疗肝癌,实验结果表明该病毒能一定程度上杀伤肿瘤细胞,与化疗药物或携带其他腺病毒联用效果更佳。基于以上研究根据,本研究构建了携带TRAIL基因的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL,希望利用Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒更强的肿瘤感染能力与杀伤作用,提高TRAIL的肿瘤杀伤能力。不仅如此,本研究还将SG235-TRAIL与化疗药泰素联用,通过体外实验探索其对胃癌的杀伤能力及安全性。1.Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL的构建在前期实验中,已经通过分子生物学技术将Ad5的fiber的knob和shaft替换为Ad35 fiber的knob和shaft,构建嵌合型Ad5/F35腺病毒骨架质粒SG235。将携带TRAIL基因的穿梭质粒pZD55-TRAIL与35型腺病毒骨架质粒SG235通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞。共转染后9-14天出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,提取腺病毒DNA并应用PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为SG235-TRAIL;同时重组出Ad5/F35嵌合型非增殖腺病毒AD5/35-TRAIL与Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-EGFP。将重组出的病毒在293细胞中反复大量扩增,通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化,并用TCID50法测得重组腺病毒SG235-TRAIL的滴度达到6.3×109pfu/ml。2.腺病毒SG235-TRAIL治疗胃癌的体外实验将携带绿色荧光蛋白（EGFP）的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-EGFP与5型增殖型腺病毒SG5-EGFP分别感染胃癌细胞SGC-7901与正常成纤维细胞BJ,结果表明SG235-EGFP对胃癌细胞的感染性强于SG5-EGFP,对正常细胞的感染性并未增强,且SG235-EGFP在胃癌细胞中能够不断增殖并增强目的基因的表达;增殖实验表明SG235-TRAIL能在胃癌细胞SGC-7901与BGC-823内大量复制,在正常细胞内复制扩增却很弱;通过ELISA、Western Blot及免疫荧光实验确定SG235-TRAIL能高效感染胃癌细胞SGC-7901与BGC-823并大量表达目的基因TRAIL;将5型增殖型腺病毒ZD55-TRAIL、增殖腺病毒SG235-EGFP、非增殖型腺病毒AD5/35-TRAIL、SG235-TRAIL及SG235-TRAIL联合化疗药紫杉醇（泰素）共同感染细胞,通过MTT与CPE实验评价细胞存活率并进行病毒的胃癌杀伤作用比较,并通过流式细胞仪检测细胞的凋亡程度以研究SG235-TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的能力。一系列体外实验结果表明SG235-TRAIL对胃癌有很强的感染能力与肿瘤杀伤作用,安全性良好;与泰素联用后SG235-TRAIL的抗肿瘤效应明显增强,对正常细胞的毒性并未明显增加。3.腺病毒SG235-TRAIL治疗胃癌的体内实验将BALB/c裸鼠皮下注射SGC-7901细胞悬液,建立胃癌动物模型。将动物随机分为4组,分别瘤内注射PBS、SG235-EGFP、AD5/35-TRAIL及SG235-TRAIL治疗。自接种之日起,定期用测量肿瘤体积;6周后将肿瘤组织取出称重,固定后制成石蜡病理切片。将肿瘤组织切片进行苏木素-伊红（HE）染色观察组织病变情况,同时做免疫组化检测TRAIL的表达及TUNEL凋亡检测。体内实验结果说明,携带TRAIL基因的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL具有良好的体内抑瘤作用,能抑制肿瘤的发生发展,疗效优于PBS对照组、AD5/35-TRAIL组与SG235-EGFP组。综上所述,我们构建了携带TRAIL目的基因的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL,其对胃癌的疗效明显强于传统病毒基因治疗,与化疗药泰素联用后效果更佳。该方案充分发挥了病毒治疗与基因治疗相结合的优势,为胃癌等实体肿瘤的治疗提供了一种新的思路。