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鸡球虫病是由艾美耳属的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)等7种球虫单独或混合感染肠道不同部位所引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病。目前使用抗球虫药是防治肉仔鸡球虫病的主要手段,但抗药性和药物残留等问题限制了球虫药物的广泛应用。从长远观点出发,基因工程苗和核酸疫苗是最终控制鸡球虫病的必然选择,而鸡球虫保护性抗原基因的筛选是研制基因工程苗及核酸疫苗研究的基础。入侵相关蛋白是目前研究较多的球虫抗原,主要包括子孢子/裂殖子表面蛋白、以及微线、棒状体、折光体等分泌型亚细胞器抗原。Tomley等(2004)分析了来自E. tenella的子孢子和第二代裂殖子的EST序列,得到了潜在的具有GPI锚定结构域的表面抗原的mRNA序列,研究表明只有一种特定的EtSAGs在子孢子上表达,小部分在两个阶段都有表达,而大部分主要在第二代裂殖子上表达。本研究对鸡E. tenella表面抗原SAG5、SAG10基因(二者均在子孢子入侵和裂殖子生殖阶段有表达)进行了克隆与原核表达,为进一步研究其免疫原性及其它生物学功能奠定基础。(1)本研究根据Tomley等报道的E. tenella豪顿株的SAG5、SAG10基因设计特异性引物,以RT-PCR方法克隆了E. tenella杨凌株SAG5、SAG10基因序列(GenBank Locus:EF635426、EF649989),分别与豪顿株相比,核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性均达98%以上,这说明SAG5、SAG10基因在不同地理株之间有很高的保守性,而现阶段并没有试验证明他们在与宿主细胞之间的相互作用关系以及是否具有一定免疫原性,有待进一步试验证明。同时用SMART RACE技术获得SAG10基因的全长cDNA。(2)扩增了不含N端疏水性信号肽序列SAG5、SAG10基因,并将其克隆至表达载体上,转化大肠杆菌Rosetta菌,经IPTG诱导,实现其在宿主菌Rosetta中表达。先前表达的以pET-32a (+)为载体的SAG10蛋白为包涵体形式存在于菌体细胞内,通过不断反复摸索表达条件,通过更换pMAL-c2X为表达载体获得了可溶性的融合蛋白,并结合Amylose Resin层析获得较高浓度的目的蛋白。(3)用ELISA方法以及鸡只抗球虫感染动物实验,分别检测和统计了鸡只体内重组蛋白免疫后相应抗体效价水平和盲肠病变记分、测定克盲肠内容物卵囊数(OPG)、增重、综合抗球虫指数(ACI)等相关抗球虫感染指标。证明了重组蛋白免疫后能在机体内产生一定的抗体水平和抗球虫感染保护力。