论文部分内容阅读
贮精腺(sperm storage tubules,SSTs)是禽类特有的管状腺体,位于生殖道子宫阴道交界处,主要功能是长期储存精子并维持其活力,使禽类能持续生产受精蛋。贮精腺存在大量的碳酸酐酶,其中碳酸酐酶4(CAⅣ)在子宫阴道交接部大量表达,由此推测CAⅣ可能参与禽类精子储存,因此研究CAⅣ在贮精腺长期储存精子过程中的功能对探究禽类贮精腺长时间储存精子并维持其活力的生理机制具有重要意义。本试验分析鸡CAⅣ序列的生物信息,寻找蛋白的抗原表位,构建pVAX-CAⅣ-asd重组质粒,并按不同剂量免疫母鸡。将105只38周龄产蛋母鸡随机分为7组,每组15只,第1到第5组依次免疫10、50、100、150、200μg的pVAX-CAⅣ-asd重组质粒,第6组免疫100μg的pVAX-asd空质粒,第7组注射生理盐水,每组免疫2次,免疫间隔为21天。试验期内每天收集种蛋,记录产蛋量,每周采集血液,检测母鸡血清中CAⅣ抗体含量、L-乳酸含量以及母鸡生殖部CAⅣ mRNA和MCT4 mRNA的表达量,测定母鸡的体重,记数蛋黄膜的精子穿孔数,计算受精率。结果表明:1.鸡CAⅣ由316个氨基酸构成,是亲水性较强的膜结合蛋白,二级结构上α螺旋和β折叠较多,且抗原表位丰富,存在信号肽。CAⅣ蛋白有多个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点及3个酪氨酸磷酸化位点,并且第165位的天冬酰胺可能为糖基化位点。进化分析表明鸡与火鸡CAⅣ最有可能来源于同一祖先,它们的CAⅣ氨基酸序列相似性最高,为94.01%,其后依次是珍珠鸡、鹌鹑、大雁和绿头野鸭,与绿头野鸭的序列相似度最低,为84.35%,表明禽类CAⅣ具有较高的序列保守性。2.实验组血清中抗CAⅣ的抗体水平从第7 d至实验结束均显著高于两个对照组,并在免疫后第28 d达到峰值,之后抗体水平逐渐减少(p<0.05)。3.用CAⅣ重组质粒免疫母鸡,实验组母鸡UVJ部位的CAⅣ mRNA相对表达量显著低于空载体对照组和生理盐水对照组,实验组伞部CAⅣ mRNA相对表达量显著低于注射生理盐水对照组,第4-5组母鸡UVJ部位MCT4 mRNA相对表达量显著低于生理盐水对照组,5个实验组伞部MCT4 mRNA的相对表达量显著低于生理盐水对照组(p<0.05)。4.免疫组与对照组母鸡体重和产蛋量没有显著差异(p>0.05),从免疫第2周开始,200ug剂量组种蛋受精率显著降低(p<0.05)。免疫后实验组的精子穿孔数显著降低(p<0.05),L-乳酸也减少(p<0.05)。综上,CAⅣ重组质粒免疫母鸡不影响体重,降低CAⅣ和MCT4的mRNA表达量,可降低种蛋受精率、血清L-乳酸含量、蛋黄膜上的精子穿孔数,因此CAⅣ可能与MCT4共同作用,为长期维持精子活力提供适宜的微环境。