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以国内分离的牛源致病性坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum, F.n.)F4菌株基因组为模板，通过PCR和克隆技术构建高效真核表达载体，体外对重组的融合蛋白进行免疫特性和细胞毒性研究。研究内容如下：根据文献和生物信息学技术，参考GenBank已知白细胞毒素序列accession no.AF312861.3设计4对引物。利用PCR技术获得bsbse、gas-sh和sh三个基因片段，构建bsbse，gas-sh和sh三个TA克隆载体，前两者测序并提交序列。利用T4DNALigase和PCR技术获得bsbse-gas-sh和bsbse-sh两个融合片段并测序鉴定。构建pPIC9K-bsbse-sh和pPIC9K-bsbse-gas-sh真核分泌表达载体，转化原生质体KM71H酵母细胞；经过His-营养缺陷培养基，G418抗性培养基筛选和PCR鉴定，成功获得两株真核工程菌。研究表明，经1.0%甲醇诱导发酵4d，BSBSE-SH和BSBSE-GAS-SH融合蛋白分泌到培养物上清液中并表达量最大，SDS-PAGE分析重组蛋白大小分别约为53.2KD和117.9KD。在体外用Western Blot分析目的蛋白的抗原特性，结果显示两条多肽都有印迹带。但是BSBSE-SH的重组蛋白有大的杂带，估计是重组蛋白的多聚体；而BSBSE-GAS-SH的带比较明显，推测在形成三维结构的时候疏水性片段GAS起了稳定、排斥的作用。以小鼠肝上皮细胞(NCTC clone1469)和小鼠巨噬细胞(Ana-1)作为靶向细胞，通过MTS还原试验，证实F.n. LktA融合蛋白BSBSE-SH和BSBSE-GAS-SH对两种细胞都有毒性；在倍比稀释后BSBSE-SH对小鼠肝上皮细胞的毒性更大。高浓度的重组蛋白可直接诱导细胞凋亡，低浓度可刺激细胞产生抵抗力。本研究用真核表达载体对坏死梭杆菌白细胞毒素的重组蛋白进行了有效表达，为白细胞毒素A活性片段的纯化，结构、功能与F.n.亚单位疫苗的研制提供了基础数据。