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变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)在龋病的发生和发展中起重要作用，其致龋性除与对牙面的粘附作用有关外，还与产酸性和耐酸性密切相关。关于变形链球菌粘附性和产酸性的分子机制已很清晰，而对于其耐酸性的机制尤其是分子机制的研究才刚刚起步，也是近年来的研究热点之一。 研究表明变形链球菌的耐酸性包括两方面的内容：固有耐酸性(constitutive acid tolerance)和耐酸反应性(acid adaptation or acid tolerance response，ATR)，两者均与质子移位膜ATP酶(H~+-ATPase)的活性和最适pH值有关，H~+-ATPase的活性越大、最适pH值越低，则其在酸性环境中排除多余H~+的能力越强，因而越耐酸。随着现代分子生物学的发展，对变形链球菌包括耐酸性在内的应激反应的研究越来越深入，越来越多的与耐酸性相关的基因也陆续被发现。其中最行之有效的方法是转座因子诱变技术，即利用转座因子能够在基因组中随机移动位置的特性，诱导转座因子插入到基因组的不同位置，产生在不同位点突变的突变株库，用合适的筛选方法筛选出某种表型发生突变的突变株，如果该突变株表型的改变是由于转座因子的单一插入引起的基因水平的变异，则转座因子插入位点必然与该表型有关。运用各种分子生物学手段发现转座因子的插入位点及其侧翼基因，进而分析该位点所在基因或其侧翼基因对该表型的调控机制。研究表明对变形链球菌的转座因子诱变使用转座因子Tn917最方便且有效。 变形链球菌UA159是目前为止唯一一株已知基因组全序列的变形链球菌，它的测序成功为研究变形链球菌基因提供了捷径。对于已知表型而未知其调控基因的变形链球菌的分子遗传学研究，选用变形链球菌UA159作为实验菌株的优点在于，只要发现了与该表型相关的位点附近的一小段基因，即可到Genbank中查找其上下游的基因，进而分析其调控机制。 本研究首次采用转座因子Tn917随机诱变变形链球菌UA巧9，成功地筛选出了一株对酸敏感的变形链球菌耐酸性缺陷突变株b23，Southem杂交和遗传回交试验证实b23表型的改变(即耐酸性的降低)是由于转座因子Tn917的单一插入所引起的基因水平的变异所致。对比变形链球菌UA159野生株及耐酸性缺陷株b23蔗糖依赖性粘附，二者无差别，故b23不适宜做龋病替代治疗的效应菌株;对比二者在不同pH值时的生长、糖酵解耐酸性、H十一‘即ase活性和致死性pH值，证实变形链球菌b23在耐酸性的各个层面均比UA159差。最后，用不对称PCR法获得转座因子Tn917插入位点5’侧的基因片段，经BLAST分析找出其在变形链球菌UA159基因组中的位置，再根据已知的插入位点下游的基因组序列和Tn9l73’端序列设计引物，PCR扩增出插入位点下游的序列，分析其上下游基因，试图寻找一个新的与变形链球菌耐酸性相关的基因并探讨其可能的调控机制。 本研究分以下三部分进行: 第一部分变形链球菌耐酸性缺陷株的构建 首先，碱裂解法和聚乙二醇沉淀法提取含转座因子Th917的温度敏感型质粒pTvl一oK，用于转化变形链球菌野生株UA159。由于变形链球菌是转化率很低的革兰氏阳性菌，所以本实验用感受态激发肤(CSP)诱导变形链球菌UA159进入易于摄取外源性DNA的状态，将转化率提高了20倍以上。其次，诱导转座因子Th917发生转座。将含质粒pTvl一OK的转化株在含抗生素的培养基中28℃生长饱和后，按不同比例稀释至新鲜培养基中并置于非允许温度(37一42℃)下培养过夜，摸索出最佳的诱导Th917发生转座的条件为1:100或1:200稀释至新鲜的不含抗生素或含0.04p创inl红霉素的培养基中，42℃培养过夜。第三，从大量的发生转座的转座株库中筛选在pHS.O的固体培养基上不能生长的突变株，即为耐酸性缺陷株。从2316个转座株中成功地筛选出一株对酸敏感的耐酸性缺陷株，命名为变形链球菌b23。第四，以含部分Th917的片段的DIG标记探针和EcoRI消化的变形链球菌UA巧9和b23基因组进行Southem杂交，结果证实耐酸性缺陷株b23的基因组中有且只有单一的Th917的插入。将耐酸性缺陷株b23的基因 II组DNA转化入另一株变形链球菌野生株MT8148中(遗传回交实验)，转化后的细菌耐酸性较野生株降低。Southern杂交和遗传回交实验的结果证实了耐酸性缺陷株b23表型的改变(即耐酸性的降低)是由Tn917的单一插入所引起的基因水平的变异所致。 第二部分变形链球菌耐酸性缺陷株生化特征的研究 对比变形链球菌野生株UA巧9和耐酸性缺陷株b23的粘附性，探讨b23是否适合作为龋病替代治疗的效应菌株。对比二者在不同 pH值的固体培养基的生长情况及在不同pH值的液体培养基中的生长曲线;对比二者的糖酵解降低曲线及糖酵解最低pH值;对比二者的戌I下ase活性;对比二者的致死性pH值。结果表明，b23的粘附性与UA159相比并没有显著增强，故不适宜用于龋病的替代治疗;在pH7.o的固体培养基上，b23生长良好，与野生株无差异，在低pH值培养基上，b23生长均差于UA159，在pHS.0时b23不能生长，而UA159尚有部分生长;在含过量糖的培养基中，UA159在pH7.5和pHS.