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目的近年来,PD-1/PD-L1抑制剂通过抑制PD-1/PD-L1信号通路,激活自身免疫系统,在多种肿瘤的临床应用中取得了不错的疗效,成为研究热点。检测肿瘤细胞PD-L1的表达水平已成为免疫检测点阻断性抗体疗效评价的重要手段。放疗联合PD-1/PD-L1抑制剂免疫治疗可能是非小细胞肺癌患者的最新治疗方案,但其联合治疗的优势人群及治疗时机仍未阐明。血清可溶性PD-L1可能和患者的肿瘤组织PD-L1及免疫状态相关,阐明其在肺癌患者中的表达具有重要意义。该研究拟采用ELISA方法检测不同分期非小细胞肺癌患者外周血血清中可溶性PD-L1的表达水平,并动态检测sPD-L1在放射治疗前、中、后的表达水平,分析其变化趋势和患者的疗效、生存的相关性,评估检测血清中sPD-L1表达水平在NSCLC患者的临床诊断、疗效预测、预后判断中的潜在作用。探讨PD-1/PD-L1抑制剂和放射治疗联合治疗NSCLC患者的时机,为进一步的基础研究和临床试验提供一定的参考。方法我们将2013年10月至2016年10月间收治的经组织活检病理诊断明确且无EGFR基因敏感型突变的136例NSCLC患者和随机抽取的健康体检人群中的61名志愿者作为受试对象。按照肿瘤分期不同分组,把NSCLC患者分为立体定向放疗治疗组(Ⅰ-Ⅱ期NSCLC患者,命名为SBRT组)和调强放射治疗组(Ⅲ期NSCLC患者,命名为IMRT组)。SBRT组患者接受针对局部病灶的射波刀立体定向放射治疗,采用CYBER-KNIFE治疗系统,给予PTV处方剂量为DT 48-60 Gy,采用大分割照射技术,8-15Gy/f/d,1f/d,共3-6f。IMRT组患者接受调强放射治疗,采用直线加速器6MV-X线常规分割照射,要求95%等剂量线覆盖PTV,处方剂量DT60Gy,2Gy/f/d,5f/w。IMRT组患者联合同步化疗加序贯化疗,腺癌患者选用多西他赛联合顺铂方案,鳞癌患者选用吉西他滨联合顺铂方案。在未经干预情况下,抽取全部受试对象空腹静脉血5ml,提取血清后置于-80℃的低温冰箱储存备用。并分别在SBRT组患者射波刀开始治疗日的第14天和射波刀治疗结束日第3个月,以及IMRT组患者放射治疗开始日的第14天、第28天、第42天和放疗结束日的第3个月的不同时间点,同法抽取血样并储存备用。适时对所采集血样行ELISA法检测其sPD-L1表达浓度。方法:将0.1ml样品血清置于包被过PD-L1抗体的反应孔中,经孵育、洗涤后,加酶标抗体并加底物液显色后终止反应,在酶标仪上检测sPD-L1浓度并记录。随访并登记患者的疗效、疾病无进展时间、总生存时间等信息。近期疗效采用RECIST实体瘤疗效评价标准评估。放射反应采用RTOG急性放射损伤分级标准与RTOG/EORTC晚期放射损伤分级标准评价。统计学处理:应用GraphPadPrism 6.0软件绘制sPD-L1表达水平的散点图、趋线图。所有统计数据,采用SPSS 22.0软件进行统计分析并绘制生存曲线图。正态分布数据以?±S描述,统计分析采用t检验,非正态分布数据以M(Q1,Q3)描述,统计分析采用非参数分析,计量资料用率表示,行x2检验,方差不齐数据的相关性分析采用秩和检验,单因素生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素生存分析采用Cox Regression法,均以P<0.05为差异有统计学意义。结果健康对照组,男女比例2.1:1,平均年龄63.7岁(36-76岁),均满足以下要求:无严重的各系统慢性疾病,无全身免疫性疾病,无传染性疾病,3个月内无外伤史和急性感染病史,无家族性肿瘤病史的。所有非小细胞肺癌患者总体男女比例1.89:1,平均年龄66.4岁(36-85)。SBRT组治疗结果:共29例非小细胞肺癌患者纳入SBRT组,男女比例2.63:1,平均年龄72.5岁。CR 5例(17.2%),PR 21例(72.4%),SD 2例(6.9%),PD1例(3.45%),近期有效率(CR+PR)89.7%,临床受益率(CR+PR+SD)96.6%,中位总生存期(OS)21个月,3年总生存率82.6%。IMRT组治疗结果:共107例非小细胞肺癌患者纳入,男女比例1.74:1,平均年龄61.8岁。CR 0例(0%),PR75例(70.1%),SD 32例(29.9%),PD 2例(1.9%),近期有效率(CR+PR)70.1%,临床受益率(CR+PR+SD)98.1%,中位OS17个月,3年生存率39.4%。ELISA检测血清中sPD-L1的结果显示健康对照组、SBRT组和IMRT组初始状态下的sPD-L1表达水平分别为176.97pg/ml(168.92,185.04),188.44pg/ml(181.69,193.74)和208.44pg/ml(196.95,223.45)。非参数检验结果提示三组总体和每两组间初始状态下的sPD-L1表达水平存在显著性差异,有统计学意义(P<0.01)。再将所有非小细胞肺癌患者按详细肿瘤分期分为ⅠA3、ⅠB、ⅡA期、ⅢA期、ⅢB期、ⅢC期共6个亚组,进行各亚组初始状态下sPD-L1表达水平的非参数检验,结果显示分组之间存在渐进显著性差异(P<0.01),可以说明肿瘤分期越晚,sPD-L1表达水平越高。根据全部受试者初始状态下血清中sPD-L1的表达值绘制ROC曲线,ROC积分面积为0.870,P<0.01,95%可信区间是0.820-0.921,取得cutoff值为187.17pg/ml,敏感性0.787,特异性0.779。提示检测sPD-L1表达对诊断NSCLC有参考意义。按照SBRT和IMRT分组,分别进行治疗前后sPD-L1表达数据的秩和检验,结果显示sPD-L1表达水平在开始放疗后呈进行性下降趋势,其变化幅度存在显著差异(P<0.01),且和治疗疗效相关,治疗疗效越好,sPD-L1表达水平降低幅度越大。IMRT组放疗结束3个月后,部分患者肿瘤进展,其sPD-L1表达水平上升,差异有统计学意义(P<0.01),提示sPD-L1表达水平和判定预后有关。按组别不同,分别在治疗前(sPD-L1d0)和治疗后(SBRT组取sPD-L1d14;IMRT组取sPD-L1d42)检测到的sPD-L1表达值之间求差,再把差值排秩,取其中位数作为分界点,将各组内患者分为sPD-L1表达值高变化率组和sPD-L1表达值低变化率组,采用Kaplan-Meier法进行组间生存率分析,结果显示:SBRT两亚组间生存率无显著性差异(P=0.926)。IMRT两亚组间生存率有显著差异,差异有统计学意义(P=0.003),说明放射治疗前后sPD-L1表达值降低幅度大者的生存时间更长,多因素生存分析证实sPD-L1表达值降低幅度大是一个独立预后因素(HR=0.381,P=0.033)。进一步分析显示sPD-L1表达值降低幅度随着放疗照射剂量的增加而加大,但尚无法排除时间因素的干扰,仍有待进一步的研究。结论通过本研究,我们发现sPD-L1在健康人群和非小细胞肺癌患者的外周血中均有表达,NSCLC患者的表达水平高于正常人水平,且随着肿瘤分期越晚其表达水平越高。当给予患者放射治疗(联合或不联合化疗)后,sPD-L1的表达水平呈现下降趋势,这种趋势又和NSCLC患者的疗效、预后相关,其降幅越大,越提示有效和生存期的延长。当患者肿瘤进展时,其sPD-L1表达水平又随之升高,这些变化的差异均有统计学意义。因此,用ELISA法检测NSCLC患者血清中sPDL1的表达水平,可以为NSCLC的诊断提供一定的参考,并且可以通过动态检测sPD-L1表达值的变化,来预测疗效以及预后,其临床参考意义的价值有待进一步的相关研究结果予以验证。