三种鳜类线粒体基因组的克隆及其系统进化分析

来源 :广西师范大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:lxj364199013
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鳜类隶属于鲈形目,为东亚特有的淡水鱼类,主要分布在中国,韩国,日本和朝鲜。以分子生物学为基础的研究手段逐渐成为研究物种研究生物的系统进化关系,物种多样性和物种形成机制的主要手段。线粒体DNA缺乏组蛋白保护和完善的自我修复系统,又靠近内膜呼吸链,极易受环境影响,进化速率快,是研究物种起源于进化的有力工具。本论文通过克隆了3种鳜类鱼类(翘嘴鳜Siniperca chuatsi、大眼鳜Siniperca kneri、斑鳜Siniperca scherzeri)的完整线粒体基因组序列,初步确定了鳜类鱼类线粒体基因组克隆的方法;比较了最常见的3种鳜类鱼类的基因组序列,分析他们的基因排列顺序和基因结构与组成;利用完整鳜类鱼类的线粒体基因组序列做进化分析,探讨鳜类鱼类的起源与线粒体DNA编码蛋白基因的适用性。(1)三种鳜类鱼类基因组序列的测定采用常规PCR技术,利用14对PCR引物,扩增出14段相互重叠的片段,采用PCR产物直接测序的技术,扩增出翘嘴鳜(S. chuatsi)、大眼鳜(S. kneri)和斑鳜(S.scherzeri)的线粒体基因组全序列,序列全长非别为16,496,17.002,16,585bp,GenBank的登录号分别为JF9725768、JN378751、JN084101。实验结果表明,本研究’所选用的14对PCR引物对扩增鳜类鱼类的线粒体基因组具有较好的通用性,操作简单。对比线粒体与GenBank中收录的其他鱼类的线粒体发现鳜类鱼类和其他鱼类一样均由13个编码基因(ND1-ND6、ND4L、CO1-CO3、CYTB),22个tRNA基因,2个rRNA基因(12SrRNA、16SrRNA)以及一个位于重链的控制区(D-Loop区域)组成。整个基因组排列紧密,少有空隙,甚至出现基因重叠。(2)三种鳜鱼的线粒体基因组比较分析通过对所克隆的3种鳜类鱼类(S. chuatsi、S.kneri、S.scherzeri)的比较分析,发现三种鳜类鱼类的基因排列顺序一致,与已报道的硬骨鱼也相同,同时G碱基在三种鳜类鱼类含量都很低,分别为16.2%(S. chuatsi),16.2%(S. kneri)和16.5%(S. scherzeri)。特别是在13个编码基因的第三位密码子中仅仅为7.1%,7.1%,8.2%。13个编码蛋白基因中,存在3个明显的基因重叠区域:ATP8和ATP6(10bp)、ND4和ND4L (7bp)、ND5和ND6(3bp)。鳜类线粒体编码的22个tRNA除了两个氨基酸(tRNA-leuUUA(R), tRNA-leuCUA(N); tRNA-SerUAN(A) and tRNA-SerAGY(C))其余的18个氨基酸均只出现一次。而22个tRNA按照位置排列可以分为3个基因簇-IQM(isoleucine, glutamine, methionine), WANCY(tryptophan, alanine, asparagine, cysteine, tyrosine)和HSL (histidine, serine, leucine)。在非编码区,用重链编码的控制区可以找到一个终止序列区(TAS-1, TAS-2, TAS-3),一个中央保守区(CSB-1,CSB-2,CBS-3和D-box)。同样位于轻链tRNA-Asn和tRNA-Cys之间具有一段保守的起始序列((5’-CCCGG-3’)。(3)探讨鳜类鱼类的起源与线粒体DNA编码蛋白基因的适用性。通过对GenBank数据库中获取的38种鲈形目鱼类的完整线粒体基因组,通过单个基因和基因拼接序列比较,利用N-J法构建系统进化树,综合考虑置信度和信息量,对13个编码蛋白基因(ND1-ND6、ND4L、CO1-CO3、ATP8、ATP6、CYTB)的系统进化能力进行评估。认为置信度大于70的为有效分支,参考前人的结果,将13个基因进行系统进化分析的适用性分为四个等级:最好的为ND5, ND4和ATP6;较好的为CO3,ND2, CYTB,ND6,一般的为CO2,ND4L,CO1,差的为ND1,ND3,ATP8。利用13个编码基因的拼接序列构建的N-J进化树显示鳜类鱼类为单系起源,同时,进化结果显示,翘嘴鳜和大眼鳜为姐妹群,而斑鳜出现的年代较早。比较3种鳜类鱼类的CYTB基因的多态性,CYTB序列的差异主要是由于碱基的颠换引起的,在所发生突变的67个位点中,C←→T碱基间的转换数最高,达到44个位点占总突变率的46.3%。其次是A←→G之间的转换数达到23个,占总差异位点的24.2%。
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