肺癌是全球范围内发病率与死亡率最高的恶性肿瘤,严重威胁人类的健康和生命。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的组织学类型,约占肺癌总数的80%。NSCLC起病隐匿、发展迅速,近75%的患者首诊时病变已属局部晚期或转移性肺癌,且易对化疗药物产生耐药性。由于现阶段缺乏有效的治疗药物,NSCLC的复发率一直高居不下,患者往往预后不良。因此,制定新的研发策略,寻求高活性靶向药物,成为NSCLC治疗的重要途径。趋化因子受体CCR5是I型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)进入靶细胞的辅助受体,在HIV感染过程中发挥关键作用,目前作为药物筛选的重要靶点,广泛应用于抗艾药物的设计与研发。近年来,随着肿瘤免疫学及分子生物学等相关学科的迅速发展,CCR5在肿瘤发生、发展过程中的重要作用逐渐被揭示。临床研究显示,CCR5在NSCLC患者中异常高表达,并可预测其不良预后。另有研究表明,CCR5在NSCLC的演进过程中发挥了关键作用,肿瘤来源的CCR5通过与其配体相互作用,介导肿瘤增殖、浸润并调节抗肿瘤免疫应答。基于上述理论依据,本课题在前期选用CCR5拮抗剂Maraviroc(MVC)开展其对NSCLC的抗肿瘤活性研究。研究发现,MVC可有效抑制NSCLC细胞的转移,在高浓度下可抑制肿瘤的生长。这一结果表明,CCR5可能是NSCLC治疗的重要靶点。基于前期的探索研究成果,本课题以CCR5作为药物靶点,采用计算模拟结合生物学实验的方法,筛选特异性高、抗肿瘤活性强的CCR5靶向阻断药物,并对其抗NSCLC的作用机制进行了初步探讨。主要研究内容和结论如下:(1)采用逐层虚拟筛选的方法发现具有潜在抗肿瘤活性的CCR5拮抗剂:本研究以CCR5为靶标,MVC为对照分子,借助Libdock、Surflex-Dock和CDOCKER等对接模块对药物信息数据库进行虚拟筛选,综合考虑对接得分、理化性质以及后续实验的可行性,挑选了15个化合物进行分子动力学模拟和MM/GBSA结合自由能计算。充分对比各化合物与CCR5的相互作用以及结合亲和力后,最终确定nifeviroc为潜在的具有抗肿瘤活性的CCR5拮抗剂。(2)探讨CCR5拮抗剂对A549细胞增殖的影响及作用机制:采用CCK8法、Edu染色法、克隆形成实验及流式细胞术等方法检测CCR5拮抗剂对A549细胞生长、增殖等生物学行为的影响。结果显示,与MVC相比,nifeviroc对NSCLC细胞具备更强地抑制作用。Nifeviroc作用A549细胞后,有效地抑制了细胞的生长及增殖活性。其通过促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21的表达,调控细胞周期蛋白Cyclin D1、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4的活性,干扰细胞周期进程,进而使细胞周期停滞于G0/G1期。(3)探讨CCR5拮抗剂对A549细胞凋亡的影响:Hochest 33258染色法、Annexin V-FITC/PI双染色法、JC-1染色法及DCFH-DA探针法检测结果显示,与MVC相比,nifeviroc具有显著促NSCLC细胞凋亡的作用。Nifeviroc通过促进细胞内活性氧水平升高,引起线粒体膜电位的降低,进而诱导细胞凋亡。(4)探讨CCR5拮抗剂诱导A549细胞凋亡的机制:(1)通过RT2Profiler?PCR array分析细胞的基因表达变化。结果发现,经nifeviroc(15μM)作用后,A549细胞中差异表达基因共84个,其中17个基因上调≥1.5倍,33个基因下调≥1.5倍。内源性和外源性凋亡途径中均有差异基因出现。(2)Western blot和Caspase活性检测结果显示,nifeviroc所致的凋亡过程伴有Caspase-9、Caspase-8、Caspase-7和Caspase-3的激活。Nifeviroc作用于A549细胞后,促使细胞内Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax共同作用于线粒体,致使线粒体膜通透性增加,引起线粒体膜电位降低,线粒体功能受损。线粒体膜通透性增加促使Cyt c释放于胞质,与Caspase-9共同作用Caspase-3和Caspase-7,并使其活化。活化的Caspase-3、Caspase-7作用于PARP酶原,使其发生剪切,丧失修复DNA损伤的能力,进而导致细胞凋亡的发生。此外,nifeviroc还可以降低survivin蛋白的表达,进而解除survivin对Caspase-3合成的抑制作用。(5)探讨CCR5拮抗剂对A549细胞迁移和侵袭的影响:细胞基质粘附实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验及基质胶侵袭实验结果显示,nifeviroc能显著抑制A549细胞粘附及体外侵袭迁移能力。(6)探讨CCR5拮抗剂抑制A549细胞转移的作用机制:细胞外基质及与细胞粘附相关因子检测结果显示,nifeviroc可通过抑制A549细胞中基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达,促进组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1和TIMP-2的作用,使其抑制MMPs对ECM的降解,进而减少A549细胞对基底膜的破坏,发挥抑制细胞侵袭转移的作用。(7)CCR5与拮抗剂相互作用机理的分子模拟研究在完成nifeviroc的体外抗肿瘤活性评价及其作用机制的初步探讨后,本研究借助分子动力学模拟和MM/GBSA结合自由能计算等方法探讨了nifeviroc、MVC与CCR5的相互作用机理。研究结果表明:当与CCR5发生结合时,nifeviroc、MVC均深埋于结合口袋内侧。两者分别同Tyr37、Trp86、Thr195、Tyr251、Thr259和Glu283残基形成氢键,加强与CCR5受体的相互作用。CCR5-nifeviroc与CCR5-MVC复合物体系的RMSF值显示,两者共享了相似的RMSF分布及动力学特征趋势,分别在N-末端、C-末端及胞内、胞外环区具有较高的RMSF值。CCR5-MVC复合物在N-末端和C-末端的柔性略大于CCR5-nifeviroc复合物,而ICL的柔性则恰好相反。在药物结合位点和跨膜螺旋区域,CCR5-nifeviroc具有更低的RMSF值,表明nifeviroc与CCR5结合增加了结合口袋和跨膜区的结构稳定性,有利于维持其与CCR5的结合状态。结合自由能的计算结果显示,nifeviroc与CCR5的亲和活性高于MVC,其中nifeviroc与Trp86和Glu283之间的氢键作用以及非极性贡献是导致两者亲和活性差异的主要原因。综上所述,本课题通过逐层虚拟筛选方法获得的CCR5拮抗剂nifeviroc具有较高的体外抗肿瘤活性,可以有效抑制NSCLC细胞的生长和转移,研究结果初步证实了CCR5拮抗剂用于NSCLC治疗的可能性。本课题借助分子模拟方法探讨了nifeviroc对CCR5的抑制机理,为更深入的科学研究奠定基础,为NSCLC治疗药物的研发提供重要的理论依据。