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尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（Uridine-5’-Diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc）是糖核苷酸中非常重要的一员,其合成方法的研究一直是国内外关注的热点。固定化酶合成具有高效,稳定性好,酶可重复利用,产物纯化简单等优点,为工业化生产提供了新的方向。基于此,本课题设计了一条全新的UDP-GlcNAc合成途径,无需昂贵辅料ATP的加入,降低生产成本,还探究了双酶共固定化合成UDP-GlcNAc及其衍生物的方法,组装的流动合成装置实现了对UDP-GlcNAc的g级合成。研究内容概括如下:（1）创建了一条以几丁质为原料合成UDP-GlcNAc的新途径。以几丁质作为原料,在几丁质酶（来自海洋细菌Paenicibacillus barengoltzii的PbChi70）的催化下合成产物N,N-二乙酰基壳二糖（N,N’-diacetylchitobiose,（GlcNAc）2）,在磷酸化酶（来自海洋细菌Vibrio furnissii的Vf.ChbP）和磷酸盐催化下合成N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸（N-acetylglucosamine-1-phosphate,GlcNAc-l-P）,在人源 UDP-GalNAc 焦磷酸化酶 AGX1 和尿苷三磷酸（uridinetriphosphate,UTP）的作用下催化合成终产物UDP-GlcNAc。1g几丁质可以合成0.71 g UDP-GlcNAc,因此该条途径在不添加ATP的情况下极大地降低了成本。（2）构建了一条UDP-GlcNAc及其衍生物的合成路径。以N-乙酰氨基葡萄糖及其类似物为原料,在N-乙酰己糖胺-1-激酶（来自Bifidobacterium longum的NahK）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的催化下合成 Sugar-1-P,再引入人源 UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1和三磷酸尿苷（uridine triphosphate,UTP）催化合成UDP-GlcNAc及其衍生物。（3）制备单酶固定化体系。分别将三种酶Vf.ChbP,NahK,AGX1与阳离子结合模块Zbasic2进行N-端融合构建融合蛋白Zbasic2-Vf.ChbP,Zbasic2-NahK,Zbasic2-AGX1。采用阳离子交换树脂purolite MS/C作为载体,直接从细胞裂解液中对酶进行固定化。经过反应条件优化后,固定化酶 Zbasic2-Vf.ChbP,Zbasic2-NahK 和 Zbasic2-AGX1 合成 UDP-GlcNAc产率分别为97.8%,72.5%和76.2%。这三种单独固定化酶分别在循环利用33次,20次和19次后依然保留了 50%以上的初始活性。（4）制备双酶共固定化体系。采用制备单酶固定化体系相同的方法,以阳离子交换树脂 purolite MS/C 作为载体共固定化 Zbasic2-Vf.ChbP＆Zbasic2-AGX1 和 Zbasic2-NahK＆Zbasic2-AGX1。经过反应条件优化后,共固定化酶Zbasic2-Vf.ChbP＆Zbasic2-AGX1和Zbasic2-NahK＆Zbasic2-AGX 1 合成 UDP-GlcNAc 产率分别为 94.6%和 89.3%,分别循环利用28次和15次后均保留了约60%的初始活性,酶的转换数分别为21.4 g/g和38.9 g/g。（5）利用共固定化酶 Zbasic2-NahK＆Zbasic2-AGX1流动合成 UDP-GlcNAc。以 12 mM GlcNAc为底物,在恒流泵的作用下连续不断地合成UDP-GlcNAc。共循环6次,前三次循环反应产率均达到了 100%,平均产率为66.7%,共生成1.456 g UDP-GlcNAc。折合到1L NahK和1 L AGX1菌液可以合成约14.56 g UDP-GlcNAc。共固定化酶的质量为2.79 mg,酶的转换数为521.9 g/g。（6）利用双酶共固定化体系制备UDP-GlcNAc衍生物。在共固定化酶Zbasic2-NahK＆Zbasic2-AGX1的重复利用催化下共合成了五种UDP-GlcNAc衍生物（UDP-GalNAc,UDP-GlcNAz,UDP-GlcNTFA,UDP-GalNTFA,UDP-GlcNAc6S）,共固定化酶的转化数是游离酶的2～8.4倍。本课题创建的一条以几丁质为底物的合成途径,为UDP-GlcNAc的合成方法提供了思路;共固定化酶合成体系的建立,使酶的稳定性有所提高,实现了酶的重复利用,流动合成为规模化制备UDP-GlcNAc及其衍生物提供了一种非常具有潜力的方式,同时也为开发一种固定化Leloir糖基转移酶的广泛适用性方法奠定了基础。