[研究背景]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,且发病率仍在不断升高,严重危害世界女性健康。作为对化疗比较敏感的实体瘤之一,化疗是其不可替代的治疗手段,然而乳腺癌多药耐药的出现成为导致乳腺癌化疗失败的重要原因。多药耐药也称交叉耐药,即肿瘤对一系列结构、靶点和作用机制不同的药物均产生耐药性,其发生涉及多重机制。MDR1基因编码的P-糖蛋白(MDR1/P-gp),作为ATP结合盒膜转运蛋白超家族的成员,可通过水解ATP获得能量将进入细胞内的药物泵出,降低药物的浓度及毒性,介导多种肿瘤的多药耐药。P-糖蛋白介导的多药耐药约占乳腺癌多药耐药的55%,因此对MDR1/P-gp进行干预成为逆转乳腺癌的化疗耐药的重要途径。尽管已开发了多种针对MDR1/P-gp的抑制剂及调节剂,但治疗浓度的毒性及副作用限制了其应用；免疫学治疗、中药等天然药物治疗以及基因治疗也未能完全逆转耐药。近年的临床前研究中基于调控P-糖蛋白转录的信号通路的分子靶向治疗崭露头角。Yamada等在结肠癌中的研究表明,人类MDR1基因启动子区包含多个Tcf4/LEF:结合基序,MDR1是β-catenin/Tcf4/LEF转录复合物的直接靶基因,抑制Wnt/β-catenin信号传导通路可下调MDR1的表达。Wnt/β-catenin信号通路对多种肿瘤发生发展均起重要调控作用,其中包括乳腺癌。β-catenin蛋白是通路的核心,Wnt信号蛋白与膜表面的Frizzled受体结合使通路活化,大量β-catenin进入细胞核内,与TCF/LEF结合形成β-catenin/TCF/LEF转录复合物,从而调节下游靶基因的转录。研究者已发现Wnt蛋白的受体Frizzled (FZD)1/2在乳腺浸润性导管癌中过表达,作为Wnt/β-catenin通路必不可少的组成元件,其表达的改变可影响通路的调控。近年有报道证实,FZD1在神经母细胞瘤中可通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控MDR1的表达影响神经母细胞瘤化疗耐药。我们检测了FZD1在乳腺癌敏感细胞MCF-7和MDA-MB-231以及多药耐药细胞MCF-7/ADM中的表达,发现其在多药耐药的ADM细胞中无论mRNA水平还是蛋白水平均显著高于敏感株。对敏感株给予不同浓度阿霉素进行诱导,72h后检测FZD1及MDR1mRNA水平的表达,发现在低至中浓度阿霉素诱导下二者均明显升高,提示FZD1及Wnt/β-catenin通路在乳腺癌细胞获得性多药耐药的发生发展中的潜在作用。因此在本研究中我们设计小干扰RNA (siRNA)载体转染乳腺癌耐药细胞后沉默FZD1以期下调MDR1/P-gp1的表达、逆转多药耐药性并探讨Wnt/β-catenin通路在其中的调控作用。[研究方法]1.分别用RT-PCR及Western blot方法检测实验室培养的3种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及多药耐药细胞MCF-7/ADM中FZD1及MDR1基因的表达情况。并分别将敏感细胞MCF-7、MDA-MB-231转染含MDR1全长cDNA序列的载体SF91m3PRE以获得耐药细胞MCF-7/MDR、MDA-MB-231/MDR。2.敏感细胞MCF-7及MDA-MB-231分别给予浓度为0,0.2,1,5μM的阿霉素作用72h后提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测FZD1及MDR1mRNA水平表达的改变。3.分别设计并合成针对FZD1基因的双链干扰RNA序列以及作为对照的非靶向性干扰序列,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达载体pSUPER-siFZD1和pSUPER-siNotarget。酶切及测序鉴定正确后,大量扩增。4.上述干扰质粒载体分别转染3种多药耐药细胞中,培养48h后,通过RT-PCR检测各组细胞中FZD1mRNA和MDR1mRNA的表达情况,应用Western blot检测FZD1蛋白和P-糖蛋白表达情况,应用罗丹明外排实验流式细胞术检测P-糖蛋白外排功能,应用MTT法检测各组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的半数细胞抑制浓度(ICso)及相对耐药指数(RR)的改变,评价FZD1干扰对细胞多药耐药性的影响。分别提取细胞浆蛋白及核蛋白,应用Western blot方法检测胞浆及胞核中β-catenin蛋白的表达情况,揭示Wnt/β-catenin通路在其中的调控作用。5.对转染后的ADM siFZD1细胞以G418筛选培养出稳定表达细胞后再转染MDR1全长载体SF91m3PRE,观察由FZD1干扰所致的耐药性改变能否被逆转。[实验结果]1.对本实验室培养的3种乳腺癌细胞系检测发现FZD1在耐药细胞ADM中无论mRNA水平还是蛋白水平均较2种敏感细胞明显升高,而MDR1/P-gp仅在ADM细胞中高表达,敏感株几乎不表达。2.MCF-7及MDA-MB-231细胞经阿霉素诱导后检测发现,在MCF-7细胞中,低中浓度(0.2μM,1μM)阿霉素作用下FZD1及MDR1mRNA水平均呈浓度依赖性升高；在致死剂量(5μM)作用下,FZD1水平下降而MDR1继续升高；MDA-MB-231细胞中,FZD1及MDR1水平则一直呈浓度依赖性升高。3.转染48h后,应用半定量RT-PCR检测各组细胞中FZD1和MDR1mRNA水平的表达情况,结果显示：与转染非靶向性siRNA的对照组相比,FZD1干扰组的FZD1及MDR1mRNA水平均明显降低。Western blot检测结果表明FZD1干扰组细胞2种蛋白的表达水平均明显降低,而胞浆及胞核中β-catenin蛋白也较对照组有明显降低。罗丹明外排实验显示,耐药细胞中罗丹明荧光含量均远低于对应的敏感细胞,而FZDl干扰后荧光含量与对照组相比均显著升高,荧光强度曲线峰值明显右移,P-gp外排功能降低。MTT法检测细胞对4种化疗药物的耐受性,发现FZD1干扰组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50明显降低,相对耐药指数显著下降,耐药性被不同程度逆转。而ADM siFZD1稳定表达细胞转染SF91m3PRE重新过表达MDR1后这一逆转又被颠覆,敏感性再次下降,证明FZD1干扰后发生的上述耐药性改变确为下调MDR1所致。[结论]1.FZD1与MDR1在乳腺癌多药耐药细胞中均呈高表达且阿霉素诱导可致二者均升高,提示FZD1与MDR1介导的获得性多药耐药相关。干扰FZDl可以抑制MDR1的表达,从而显著降低细胞多药耐药性。2.干扰FZD1后细胞浆、细胞核中β-catenin蛋白表达降低,表明Wnt/β-catenin通路被抑制,提示FZD1干扰对乳腺癌细胞耐药性的逆转是由Wnt/β-catenin通路介导的。3.FZDl可通过调控Wnt/β-catenin信号通路介导乳腺癌多药耐药,并有望成为潜在的提示乳腺癌化疗敏感性的指标及逆转耐药的靶点。