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骨骼肌的生长及发育是一个非常复杂的过程,首先肌源干细胞分化成单核的成肌细胞,然后融合形成多核肌管,最后形成成熟的肌纤维。骨骼肌的生长发育会受到很多分化相关基因的调控,主要有:生肌调节因子家族(MRFs)、肌细胞增强因子2(MEF2)和肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)以及肌肉特异性micro RNA等。最近发现的一种跨膜切割型分泌蛋白FNDC4,是III型纤连蛋白包含蛋白家族的一员,III型纤连蛋白包含蛋白家族共有五种蛋白,分别是FNDC1-5。其中FNDC4与FNDC5有最高同源性。本实验室前期实验证明FNDC4促进了牛肌肉卫星细胞分化,但在小鼠肌肉分化中的作用尚无人研究。因此,本研究以体外培养小鼠C2C12细胞系为模型来探究FNDC4在小鼠骨骼肌分化中的作用及其可能的分子机制,从而为揭示骨骼肌发育的分子机制提供实验依据。本论文的主要研究内容如下:首先利用Western blotting和免疫荧光检测FNDC4在小鼠C2C12细胞中的表达变化与定位,利用Western blotting和免疫组织化学染色技术检测FNDC4在小鼠肌肉损伤修复过程中的表达变化。采用体外添加FNDC4蛋白,FNDC4基因的过表达载体和si RNA干扰片段的方法对FNDC4基因进行过表达或抑制,明确FNDC4的表达变化能够调节小鼠C2C12细胞的分化。用Western blotting检测干扰FNDC4后对β-catenin细胞定位的影响,明确FNDC4对Wnt/β-catenin信号通路的影响。用纯化的FNDC4蛋白和XAV939处理小鼠C2C12小鼠细胞分别激活和抑制Wnt/β-catenin信号通路,利用Western blotting和免疫荧光染色技术观察小鼠肌肉细胞分化和β-catenin细胞定位的影响,明确FNDC4通过影响Wnt/β-catenin信号通路促进小鼠C2C12细胞分化。进一步采用免疫沉淀和蛋白质谱测序对可能与FNDC4结合的蛋白进行分析,发现低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein 6,LRP6)可能与FNDC4结合,并采用免疫共沉淀实验进一步验证FNDC4与LRP6的相互作用。添加FNDC4蛋白和LRP6的抑制蛋白Dickkopf相关蛋白1(DKK1)激活和抑制LRP6功能,利用Western blotting和免疫荧光染色技术观察小鼠肌肉细胞分化和β-catenin细胞定位的影响,明确FNDC4结合了LRP6影响Wnt/β-catenin信号通路进而影响小鼠C2C12细胞分化。实验结果表明:(1)在小鼠C2C12细胞分化过程中,FNDC4的表达逐渐升高,同时FNDC4的表达规律与肌分化标志基因——肌细胞生成素(Myogenin,Myo G)表达有显著的相关性,并且免疫荧光检测也表明了FNDC4蛋白在已融合的肌管中表达丰富。在小鼠肌肉损伤修复过程中,FNDC4表达水平逐渐升高,损伤后修复第5天的表达最高,之后呈下降趋势。小鼠损伤部位的修复过程同时存在增殖与分化两个过程,Western blotting和免疫荧光结果显示:对肌肉卫星细胞具有维持作用的PAX7基因首先表达,损伤后第1～5天的表达量显著升高,随后表达下降;肌分化相关基因Myo G在修复过程中表达量逐渐升高,随后表达下降,FNDC4的表达与Myo G的表达显著相关。FNDC4可能参与小鼠肌肉受损部位成肌细胞的分化;(2)Western blotting结果表明,过表达FNDC4后肌细胞生成素(myogenin,Myo G)表达量升高,而干扰FNDC4后Myo G表达量下降;免疫荧光结果表明,过表达FNDC4后肌管融合率增加,干扰FNDC4后肌管融合率下降,并且体外添加FNDC4蛋白的作用效果与过表达FNDC4一致,表明FNDC4的表达变化能够影响小鼠C2C12细胞的分化;(3)Western blotting和免疫荧光结果显示,干扰FNDC4后β-catenin在细胞核的定位减少,表明FNDC4可能是通过影响Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠C2C12细胞的分化;(4)体外添加FNDC4并且抑制Wnt/β-catenin信号通路,Western blotting结果显示核内β-catenin水平降低,肌肉分化标志分子水平显著降低;并且免疫荧光结果显示核内β-catenin减少,肌管融合率显著降低;证明FNDC4是通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠C2C12细胞分化的。(5)蛋白质谱发现FNDC4可能与LRP6相互作用,免疫共沉淀结果证明FNDC4可以与LRP6相互结合;(6)体外添加FNDC4蛋白和LRP6竞争抑制剂DKK1蛋白,Western blotting结果显示核内β-catenin水平降低,肌肉分化标志分子水平显著降低;并且免疫荧光结果显示核内β-catenin减少,肌管融合率显著降低;证明FNDC4作用于LRP6来激活Wnt/β-catenin信号通路进而影响小鼠C2C12细胞分化。本研究表明,FNDC4影响C2C12细胞分化,参与小鼠肌肉损伤的修复。此外,FNDC4可通过LRP6磷酸化激活Wnt/β-catenin信号通路,从而通过增加β-catenin的入核激活C2C12分化相关基因的转录。我们的发现为进一步探索FNDC4的作用以及研究肌肉分化和为肌肉损伤的治疗机制提供了基础。