马铃薯甲虫是重要的马铃薯食叶害虫,该虫自20世纪90年代初入侵我国新疆以来,自西向东不断扩散,现已分布于新疆北部大部分区域,对我国马铃薯种植业构成了严重威胁。目前防治马铃薯甲虫的主导药剂为吡虫啉等新烟碱类杀虫剂,对其作用靶标烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的结构与功能的研究可为该虫的有效治理提供重要的理论依据。前期研究发现新疆马铃薯甲虫对新烟碱类药剂已产生不同程度的抗性,且成虫和幼虫具有不同的耐药性和nAChR表达量,利用RNA干扰沉默马铃薯甲虫nAChR基因Ldal发现可降低成虫和幼虫对新烟碱类杀虫剂的敏感性。在此基础上,本研究继续克隆获得马铃薯甲虫Ldα3和Ldβ1两个基因,并利用双荧光素酶报告基因检测技术分析了Ldα1、Ldα3和Ldβ1三个基因的启动子活性,试图揭示nAChR在昆虫生长发育过程中表达量变化的调控机制,从而阐释nAChR表达量与昆虫药剂敏感性的相关性。本文的研究结果如下:1马铃薯甲虫Ldα3和Ldβ1的克隆、序列分析及时空表达谱为了明确马铃薯甲虫nAChR分子结构及功能,根据其基因组数据库,本文利用RT-PCR克隆该虫nAChR未知亚基基因。通过相似性和进化树分析验证基因的亲缘关系,并利用定量PCR检测基因在马铃薯甲虫卵、1龄到4龄幼虫、蛹和成虫不同发育阶段,以及成虫头、胸和腹部不同部位中的表达水平。结果表明经过验证和拼接获得了马铃薯甲虫2个nAChR亚基基因的cDNA全长序列,通过Blastx比对发现其分别属于nAChRα3和nAChRβ 1亚基,因此将其分别命名为Ldα3和Ldβ1。Ldα3和Ldβ1编码的氨基酸序列具有nAChR的典型结构,与已知的昆虫同源序列有较高的相似性,且与赤拟谷盗的相似性最高;进化树分析显示Ldα3和Ldβ1与赤拟谷盗的相应基因也具有最近的亲缘关系;实时荧光定量结果表明Ldα3和Ldβ1在马铃薯甲虫不同生长发育时期均有表达,但表达量有明显差异。Ldα3在卵、1龄和2龄幼虫中的表达最高,在4龄幼虫中表达量最低;Ldβ1在1龄和2龄幼虫中的表达水平最高,卵、3龄、蛹和成虫中的表达量相对最低。Ldα3和Ldβ1在马铃薯甲虫成虫不同部位中也都有表达,在头部的表达水平显著高于胸部和腹部。本研究克隆获得了马铃薯甲虫两个nAChR亚基基因并明确了其时空表达谱,结果可为进一步的nAChR功能及新烟碱类药剂抗性研究奠定基础。2 Ldα1、Ldα3和Ldβ1基因5’端调控区的克隆与分析前期研究表明Ldα1、Ldα3和Ldβ1在马铃薯甲虫成虫和四龄幼虫中的表达水平存在显著差异,且其对药剂敏感性有一定影响。本文分析了这三个亚基5’端非翻译区(UTR)和5’端侧翼区的分子结构特征以在转录调控水平上阐明其表达调控机制。利用RACE技术获得了Ldα1、Ldα3和Ldβ1基因的5’ UTR序列。Ldα1基因5’UTR序列141bp,在133bp处插入了一段长14314bp的内含子;Ldα3基因5’UTR序列179bp,在134bp处插入了 一段长74614bp的内含子;Ldβ1基因5’UTR为262bp的序列,中间无内含子插入。通过PCR克隆验证三个基因的5’端调控区序列,分别得到Ldα1、Ldα3及Ldβ1基因1169、1606及1522 bp的侧翼区序列。利用BDGP在线分析软件预测了三个亚基基因的转录起始位点,于gene regulation网站上分析各个亚基基因调控区上可能存在的顺式作用元件。通过对Ldα1、Ldα3和Ldβ1 5’调控区的克隆与序列分析,为进一步研究这三个基因的转录调控机制奠定基础。3 Ldα1、Ldα3和Ldβ1基因的核心启动子缺失分析为了明确Ldα1、Ldα3以及Ldβ1基因启动子作用元件的确切位点以及在成虫和幼虫中表达量差异产生的机制,通过构建Ldα1、Ldα3以及Ldβ1基因5’侧翼区序列不同缺失片段的表达载体,利用双荧光素酶报告基因技术,分析比较成虫和幼虫中三个基因启动子的活性。结果表明,Ldα1基因5’端调控区具有荧光素酶活性,其核心启动子区域位于-167至-199 bp的DNA序列中,在-405～-804bp区域可能存在刺激幼虫启动子活性的顺式作用元件,在-308～-340bp区域可能存在抑制幼虫启动子活性的顺式作用元件;比对分析发现成虫和幼虫Ldα1基因的调控区序列存在核苷酸多态性。Ldα3和Ldβ1基因5’端调控区荧光素酶活性较低,且没有发现核心启动子所在区域。本研究结果明确了Ldα1启动子一些顺式作用元件的位点,分析发现了Ldα1调控区序列的核苷酸多态性可能是造成其在成虫和4龄幼虫中mRNA表达量差异产生的原因。研究结果为进一步揭示昆虫nAChR表达量的调控机制以及新烟碱类药剂的抗性机制奠定基础。