【摘 要】
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目的:口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）是最常见的口腔黏膜慢性炎症性病,病因不清,普遍被认为是一种潜在的癌前病变状态。最近有研究显示,凋亡异常在OLP疾病的发病机制中发挥重要作用。本研究采用二代测序技术（又称高通量测序）,检测OLP和正常口腔黏膜组织各2例中miRNA和mRNA的表达谱,进而从中找到具有显著差异的候选miRNA和基因,以便更好阐释OLP病损的发生发展中病生
【基金项目】
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国家自然科学基金（81400512、81170967）； 国家临床重点专科建设项目（[2013]544）； 国家卫生计生委公益性行业科研专项（201502018）；
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目的:口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）是最常见的口腔黏膜慢性炎症性病,病因不清,普遍被认为是一种潜在的癌前病变状态。最近有研究显示,凋亡异常在OLP疾病的发病机制中发挥重要作用。本研究采用二代测序技术（又称高通量测序）,检测OLP和正常口腔黏膜组织各2例中miRNA和mRNA的表达谱,进而从中找到具有显著差异的候选miRNA和基因,以便更好阐释OLP病损的发生发展中病生理因素的影响。材料和方法:根据纳入和排除标准,收集OLP临床病例和健康对照。（1）采用DESeq和edgeR软件算法筛选差异表达miRNAs和差异表达基因,构建并分析miRNAs-mRNA网络寻找具有潜在调控的miRNAs和基因。分别通过精确概率计算法以及超几何分布计算法评估,针对所有差异表达基因进行KEGG和GO数据库功能性通路/项目分析。（2）采用TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）实验检测OLP和正常口腔黏膜组织上皮中凋亡细胞,扩大样本计算上皮细胞凋亡指数（AI）。（3）预测miR-27b-3p的潜在靶基因,并采用双荧光素酶报告基因实验,qPCR检测以及免疫印迹实验来验证miR-27b-3p和预测靶基因的负调控关系。（4）进一步探究miR-27b-3p和预测靶基因参与调控凋亡进程的具体机制。结果:（1）基于高通量测序中94个显著差异miRNAs和599个差异表达基因,预测miRNA-mRNA潜在调控组合数组。整体分析OLP差异表达基因谱,其显著富集于炎症和免疫相关方面。（2）在15对OLP和正常口腔黏膜样本中验证miR-27b-3p显著下调。通过免疫印迹和流式实验,检测凋亡标记物caspase-3和凋亡细胞阳性率的水平,结果表明miR-27b-3p促进凋亡。（3）MiR-27b-3p抑制CypD mRNA非编码区（3′-UTR）、mRNA以及蛋白水平表达。通过免疫印迹和流式实验,检测凋亡标记物caspase-3和凋亡细胞阳性率的水平,结果表明CypD抑制凋亡。（4）免疫共沉淀和CypD过表达后ELISA、免疫印迹实验表明,CypD与Bcl2相互作用,增强Bcl2对线粒体细胞色素C（CytC）及其下游caspase-9的抑制作用。结论:本研究在OLP口腔损害组织中验证一个全新的miR-27b-3p调控轴（miR-27b-3p–CypD/Bcl2–CytC–caspase9–caspase3）。该轴通过CytC依赖的线粒体通路参与调控OLP上皮细胞凋亡。这条凋亡途径可能自成体系,独立于T细胞诱发上皮细胞凋亡之外。本研究为今后开展OLP分子靶向治疗提供了理论基础。
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