方格星虫（Sipunculus nudus）是一种蠕虫状的海洋生物,富含蛋白质、多糖等多种活性物质,具有极高的营养价值和药用价值。方格星虫蛋白含量丰富,约占其干重的70%以上,是其最主要的营养成分。但目前关于方格星虫功能活性物质的研究主要集中于多糖方面,而对其功能蛋白的挖掘及作用机制的研究较少。本课题通过蛋白组学技术系统解析方格星虫的全蛋白组成,从中挖掘免疫相关活性蛋白;并针对体壁蛋白的功能特性和其中免疫相关糖蛋白进行了研究。以期为方格星虫资源的深度利用提供重要途径,也为免疫型功能食品的开发提供理论依据。主要研究结果如下:（1）利用DIA蛋白组学技术对方格星虫体壁和体腔液蛋白进行分析并挖掘其主要免疫相关蛋白。结果表明,从方格星虫体壁和体腔液中共鉴定到1659个蛋白,其中体壁蛋白1373个,体腔液蛋白1566个。二者差异蛋白共539个,其中体腔液中415个蛋白表达上调,纤溶酶、胶原α-1（IV）和蚯蚓血红蛋白亚基B等上调最为显著;124个蛋白表达下调,钙转运三磷酸腺苷酶、肌球蛋白和中性胆固醇酯水解酶1等下调最为显著。GO分析结果表明,方格星虫体壁和体腔液中蛋白质主要参与催化活性和代谢过程。KEGG分析结果表明,体壁和体腔液中蛋白涉及的通路主要与细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和代谢有关,参与的主要通路有碳代谢途径、核糖体途径、氨基酸生物合成等。Pfam注释结果表明,体腔液中免疫相关蛋白主要为胰岛素样生长因子结合蛋白、过氧化氢酶、接触蛋白和成纤维细胞生长因子受体;体壁中免疫相关蛋白主要为基底膜蛋白多糖、肌联蛋白和肌球蛋白轻链激酶。方格星虫的蛋白质组学基础信息研究与解析,为方格星虫功能性蛋白的进一步挖掘和免疫相关蛋白的深入研究奠定了基础。（2）针对方格星虫的主要可食用部分体壁中蛋白的功能特性进行分析,并基于其乳化性构建稳定的高内相乳液体系。功能特性研究结果显示:方格星虫体壁蛋白溶解性为80.52%,乳化性和乳化稳定性分别为60.01 mg/m L和54.68%,表明其具有良好的溶解性和乳化特性。以方格星虫体壁蛋白为乳化剂制备高内相乳液体系（High Internal Phase Emulsion system,HIPEs）,结果表明:当体壁蛋白的固体浓度为3.0wt%,油相φ值在70～75%时,可以形成稳定的HIPEs。上述研究结果将为方格星虫蛋白在食品中的应用提供理论支撑。（3）基于蛋白组学及免疫相关蛋白分析的研究结果,对方格星虫体壁中的糖蛋白进行分离纯化,并通过SDS-PAGE、RP-HPLC等方法鉴定其纯度和分子量。结果表明,方格星虫糖蛋白粗品经Q Sepharose Fast Flow柱纯化共得到五个洗脱峰,其中糖与蛋白质重合的吸收峰共有三个,分别为F1、F2和F5。经SDS-PAGE分析可知,五个洗脱峰中仅F1的PAS染色条带与考马斯亮蓝染色条带重合,表明洗脱峰F1的蛋白组分为糖蛋白。收集洗脱峰F1蛋白组分,经超滤浓缩并透析冻干后得到糖蛋白SGP1。SDS-PAGE结果显示,糖蛋白SGP1仅在约7.88 k Da处有单一条带;RP-HPLC分析结果也显示SGP1为单一峰。上述结果表明,方格星虫体壁粗蛋白经阴离子交换色谱纯化可得到较纯的糖蛋白SGP1,其相对分子量约为7.88 k Da。（4）对SGP1的结构和理化性质进行分析。糖和蛋白质含量测定结果显示,SGP1的糖含量为3.10%,蛋白质含量为92.84%,表明其是以蛋白部分为主体的糖蛋白。氨基酸组成分析结果表明,SGP1中含量最高的五种氨基酸依次为赖氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸,含量最少的为半胱氨酸,不含组氨酸,此外,其必需氨基酸含量较高,占总氨基酸含量的49.68%。单糖组成分析结果表明,SGP1糖链主要由来苏糖、木糖和葡萄糖三种单糖组成,其摩尔比为0.87:4.16:1.36。β消去反应结果表明,SGP1中含有O-糖肽键。红外光谱图显示,SGP1具有糖和蛋白质的特征吸收峰,且糖链中存在吡喃糖构型。圆二色谱分析结果显示,SGP1中β-折叠含量为42.47%,表明其是以β-折叠结构为主的糖蛋白。DSC分析结果显示,SGP1的热变性温度为75.58℃,表明其热稳定性较好。扫描电子显微镜观察发现,SGP1为表面光滑、大小均一的球形或椭球形结构。通过LC-MS/MS对SGP1的氨基酸序列进行分析,发现其氨基酸序列与Myohemerythrin（sp|Q5K473|HEMTM）相似,序列覆盖率为28.33%,鉴定得到与该蛋白中氨基酸序列相匹配的肽段共有四条,分别为K.AHEEFLGK.L、K.DWLVQHIK.T、K.HFSDEENMMQQSK.Y以及K.TIDFK.Y。（5）通过小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型,研究了SGP1的免疫增强作用,并解析其作用机制。细胞活性测定结果表明,SGP1在10～200μg/m L浓度范围内对RAW264.7无细胞毒性作用,且在浓度高于40μg/m L时能明显促进细胞增殖。通过中性红吞噬实验研究了SGP1对细胞吞噬能力的影响,发现浓度高于20μg/m L的SGP1能使巨噬细胞吞噬能力显著增强。此外,SGP1可有效促进细胞NO以及细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌,且其促进效果与SGP1的浓度呈正相关。通过免疫荧光染色法研究了SGP1对NF-κB核转运的影响,发现随着SGP1浓度的增加,细胞内NF-κB p65表达水平逐渐升高,且逐渐向细胞核转移,说明高浓度的SGP1可激活NF-κB信号通路,促进NF-κB p65向细胞核内转移。Western blot测定结果表明,SGP1可使RAW264.7细胞中ERK、JNK、PI3K和Akt的磷酸化水平显著提高,且呈现浓度依赖性,表明SGP1能激活巨噬细胞中MAPK和PI3K/Akt信号通路,促进该通路中主要免疫蛋白的磷酸化表达,从而诱导巨噬细胞发挥免疫效应。综上所述,SGP1能促进RAW264.7巨噬细胞的增殖,增强细胞吞噬能力,还可诱导巨噬细胞启动MAPK和PI3K/Akt信号通路,并进一步使NF-κB信号通路激活,促使其转移至细胞核,进而促进细胞释放NO以及IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子,从而增强细胞免疫功能。