皮肤的创伤愈合是一个复杂的生物学过程,启动一系列复杂的生物学事件,包括炎症、组织的新生和重建。随着组织工程的发展,细胞疗法已成为治疗人体创伤的新策略。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是目前临床和基础研究中应用较为广泛的一种多能干细胞。BMSCs具有干细胞的共性,即自我更新及多向分化能力。在一定诱导条件下,BMSCs可向骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞及基质细胞等中胚层细胞分化；同时,BMSCs还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化。已有实验研究结果证实BMSCs在创面愈合方面起到积极作用。在细胞疗法中,干细胞必须先从原来定居的部位迁移到相应的组织器官内才能实现该部位的再生和修复,因此细胞迁移在组织修复中的作用至关重要。细胞迁移运动的过程是受趋化因子/趋化因子受体系统所调控的。在成熟组织内,活化素(Activin,ACT)信号可调节伤口愈合和表皮再上皮化,在皮肤创伤愈合中起着重要的作用。课题组前期发现ACT B在In vitro水平上通过JNK/MAPK信号通路促进角朊细胞的迁移；ACT B在In vivo水平上诱导创伤修复过程中毛囊的再生。另据文献报道,BMSCs表面高度表达ACT受体,ACT B/TGFβ的下游信号Smad3的缺失导致BMSCs迁移降低。这些提示我们ACT B可能诱导BMSCs迁移。在这些研究结果的提示下,本实验设想利用ACT B调整BMSCs的生物学功能,使得创面愈合实现速度和质量两方面的提升。　　 本课题在分离BMSCs的基础上,以大鼠全层皮肤缺损创面为模型,一方面利用ACT B对BMSCs进行生物学功能的修饰,寻求一种使受创组织达到解剖修复与功能重建的新的治疗方法,为创伤修复的基础研究及可能的临床应用提供理论依据。另一方面,将表皮移植、尾静脉移植及结合移植三种不同移植途径纳入同一个实验系统中进行研究,在相同实验条件和实验对照下比较不同移植途径对创面愈合的影响,以期发现更为理想的移植途径,为进一步研究提供参考。　　 (一)目的：利用ACT B对骨髓间充质干细胞进行生物学修饰,在细胞及载体水平研究ACT B诱导BMSCs对创面愈合的影响,同时探讨不同移植途径对创面愈合的影响。　　 (二)方法：利用贴壁法筛选分离BMSCs,应用流式细胞术及细胞免疫荧光方法鉴定。为了便于BMSCs的体内示踪,利用荧光染料CFSE标记BMSCs。Transwell实验检测ACTB对BMSCs的趋化作用。体外划痕实验检测ACTB诱导的BMSCs迁移能力及对体外创面愈合的影响。采用三种不同的移植途径平行移植ACT B诱导的BMSCs、BMSCs及PBS,分析ACT B诱导的BMSCs对创面愈合的影响,并讨论三种不同的移植途径对创面愈合的影响。　　 (三)结果：　　 1.BMSCs体外分离、培养、鉴定及标记:采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,原代细胞经过24h体外培养后有少量贴壁细胞,72h左右大部分细胞贴壁,4d左右细胞生长速度增快,并呈长梭形克隆样生长,7d左右达到细胞融合,形态比较均一,纯化传代到第6代时细胞的形态均一,呈扁平状或梭形。流式细胞检测第三代BMSCs表面标志CD90抗原阳性(98.83％),CD80抗原阴性(0.11％)；免疫细胞学检测第三代BMSCs表面标志CD29、CD44和CD90抗原阻性,CD80抗原阴性。荧光显微镜下可见CFSE荧光标记的BMSCs均呈绿色荧光,荧光定位于细胞膜、细胞质和细胞核,以细胞核荧光最强。流式细胞仪检测,经CFSE标记的BMSCs的细胞标记率达到99.8％。　　 2.ACT B可以诱导BMSCs迁移:transwell实验显示ACT B对BMSCs有明显的趋化作用,24h实验结果显示ACT B下室含ACT B的培养体系细胞迁移数显著高于对照组。另一方面,体外划痕实验结果显示,经ACT B诱导的BMSCs与未经诱导的BMSCs相比,划痕愈合速度明显加快。　　 3.ACT B诱导的BMSCs可以促进大鼠皮肤创面愈合:术后7d、14dACT B诱导的BMSCs的愈合速度均显著高于对照组。在创面愈合质量方面,ACT B诱导的BMSCs组一方面保留了BMSCs对汗腺皮脂腺等再生的积极效果,同时显示在毛囊再生方面发挥了积极作用。　　 4.不同移植方式对BMSCs治疗创面愈合效果影响不大:分别比较三种不同移植途径对BMSCs组及Activin诱导BMSCs组的创面残余面积及创面愈合率的影响,结果显示不同移植途径对两组的创面愈合速度没有显著性差异。　　 (四)结论：以上研究结果提示 Activin可以促进BMSCs的迁移,并能更好的促进大鼠皮肤创面愈合。