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CD40是肿瘤坏死因子受体家族里的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,除在B细胞、胸腺上皮细胞、树突状细胞、造血前体细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞等多种细胞上广泛表达,也在多种肿瘤组织细胞表面表达。越来越多的研究表明,CD40信号可在肿瘤的发生发展、新生血管生成等多个环节发挥作用,阻断CD40信号不仅可以抑制肿瘤早期发生及生长,而且可以抑制肿瘤新生血管生成及转移。众多实验表明,CD40信号与胶质瘤之间存在非常密切的关系：1.CD40信号与脑胶质瘤细胞本身存在密切关系,2.CD40信号的高表达与胶质瘤组织中新生血管形成有关,提示CD40信号的高表达与胶质瘤的发生发展、微血管形成等存在正相关性。研究目的：脑胶质瘤是神经外科中最常见的恶性肿瘤,通常以发病率高、侵袭性强、易复发为其特点,手术很难完全切除,且术后极易复发,而放、化疗缺乏治疗特异性,反而对正常脑组织功能和患者整体的免疫力造成极大损伤,因而,如何控制胶质瘤的增殖和侵袭性生长成为目前研究的焦点,希望能够找到最佳的有效治疗手段,而众多实验表明CD40信号与脑胶质瘤之间存在非常密切的关系,脑胶质瘤组织中CD40信号可能与肿瘤的血管生成、侵袭性生长等恶性生物学行为有关,因此我们通过特异性沉默CD40表达,观察脑胶质瘤细胞U87MG的增殖和迁移能力,为临床治疗脑胶质瘤提供理论依据。研究方法：①通过基因Blast和文献报道,设计干扰长度为19个碱基的特异性寡核苷酸序列：5GCG AAUUCCU AGA C ACC UG-3’,合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链,同时合成互补链,分别在5’和3’端引入BamH I和HindⅢ酶切位点。然后构建针对CD40的siRNA表达质粒pSilencer3.1-H1 neo,进行酶切鉴定和测序；②利用RT-PCR、FCM方法对RNAi质粒转染脑胶质瘤U87MG细胞进行了CD40mRNA和蛋白水平的检测,明确质粒转染对mRNA和蛋白表达水平的抑制效率；③观察质粒转染脑胶质瘤细胞U87MG的增殖能力变化：分别采用含10%FBS和2%FBS的DMEM培养基培养,置于37℃、5% CO2培养箱培养,分别于24h、28h、72h计数各平行组细胞并绘制生长曲线；④采用Transwell法检测CD40信号激发后,U87MG、U87MG-siRNA-control以及U87MG-siRNA-CD40细胞株的迁移能力,通过高倍镜视野计数穿越Transwell上室的细胞数。⑤U87MG细胞株扩大培养,两种细胞均调整浓度至1×106/50μl,在裸鼠腋下进行皮下注射,一次注射50μl,同一只裸鼠左腋下为U87对照组,右侧为干扰组。接种后观察肿瘤生长情况,记录成瘤时间,肿瘤大小,计算成瘤率。观察CD40信号对裸鼠肿瘤生长的影响。研究结论：①与亲本细胞U87MG相比,U87MG-siRNA-control细胞CD40 mRNA的表达无明显变化,而U87MG-siRNA-CD40细胞株CD40 mRNA的表达明显下降。②和亲本细胞U87MG相比,U87MG-siRNA-control细胞以及U87MG-siRNA-CD40细胞株增殖速率无明显差异。而将FBS浓度调低至2%时,加入50ng/ml的sCD40L刺激,和亲本细胞U87MG相比,U87MG-siRNA-control细胞增殖速率无明显差异,而U87MG-siRNA-CD40细胞株增殖速率明显减慢。(P<0.01)③U87MG细胞数为(70±8)细胞/HP、U87MG-siRNA-control细胞数为(74±9)细胞/HP、U87MG-siRNA-CD40细胞为(36±5)细胞/HP。④经sCD40L处理后,U87对照组肿瘤体积大,周围有大量毛细血管包绕,CD40干扰组成瘤时间相对较晚,肿瘤体积较小,血管增生不明显。小结：我们通过RNAi技术,特异性沉默脑胶质瘤U87MGCD40分子表达,可以有效控制脑胶质瘤的生长和侵袭转移,为临床治疗脑胶质瘤提供新的理论依据。