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一、背景白血病是一组造血干、祖细胞发生恶性改变,细胞失去进一步分化、成熟能力,阻滞在不同的造血阶段,从而导致的一组异质性造血系统恶性肿瘤。虽然其治疗水平近年来已有了明显提高,但仍有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治的白血病,因此积极寻求新的治疗方法在当前仍然显得尤为重要。硼替佐米(bortezomib,BOR)是一种新型抗肿瘤靶向治疗药物,目前主要用于复发或难治的多发性骨髓瘤的治疗,并已显示出良好的疗效。研究显示Bor在体外对多种恶性肿瘤细胞均有抑制作用,但在白血病方面的研究报道较少,更未见与去甲氧柔红霉素(idarubicin,IDA)联合应用的研究报告。本研究通过观察Bor与Ida联合作用于白血病细胞株K562的效果,为临床用于治疗白血病提供实验依据。二、材料与方法用硼替佐米和去甲氧柔红霉素以指定浓度和时间分别单独或联合干预K562细胞,应用MTT法检测细胞活力,分析结果得出硼替佐米与去甲氧柔红霉素单药或联合作用于K562细胞24h的细胞生长抑制率;应用Hoechst染色法对各处理组细胞进行形态学观察;应用DNA凝胶电泳法提取细胞基因组DNA通过电泳得到凋亡细胞特征性的“梯状”(ladder)DNA条带;用RT-PCR检测各处理组K562细胞survivin基因及bcr/abl基因的表达趋势;用western blot法检测各处理组K562细胞survivin和bcr/abl-p 210融合蛋白表达的变化。三、结果(1)100nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24h细胞生长抑制率为40.11%,200nmol/L去甲氧柔红霉素作用于K562细胞24h细胞生长抑制率为39.72%,两者联合作用于K562细胞的24h细胞生长抑制率为76.58%。两者联合作用时的相互作用系数(CDI)值＜1,表明两者具有协同作用。(2)阴性对照组细胞经Hoechst染色后细胞核呈均匀、弥散的蓝色荧光,而硼替佐米与去甲氧柔红霉素单独或联合处理组均可见细胞凋亡现象,表现为细胞核凝集、固缩,形成质密、明亮的蓝色荧光颗粒;且单位视野下100nmol/L硼替佐米与200nmol/L去甲氧柔红霉素联合处理组凋亡细胞数量明显多于同剂量两者单独处理组。(3)50-150nmol/L硼替佐米处理细胞12小时,DNA凝胶电泳可见明显DNALadder出现,其中50nmol/L硼替佐米处理组还可见正常基因组DNA条带和凋亡DNA Ladder共存。相同条件下,延长作用时间至24小时,各处理组仍可见明显DNA Ladder,但50nmol/L处理组正常基因组条带消失,显示随时间延长硼替佐米作用效果增强。100nmol/L硼替佐米单独或与200nmol/L去甲氧柔红霉素联合处理24小时,DNA凝胶电泳也均显示出明显DNA Ladder。(4)与阴性对照组相比,100nmol/L硼替佐米和200nmol/L去甲氧柔红霉素联合作用K562细胞24小时后,其survivin和bcr/abl mRNA表达水平均明显下降。经软件计量分析,与阴性对照组相比,BOR+IDA两药联合应用组survivinmRNA表达水平显著下调(BOR+IDA组为:0.736±0.024,对照组为:0.895±0.023,P＜0.01)。其余两组survivin mRNA表达水平均与对照组相近(BOR组为:0.881±0.019,IDA组为:0.889±0.021,对照组为:0.895±0.023,P＞0.05)。而bcr/abl mRNA表达水平亦显著下调(BOR+IDA组为:0.440±0.020,对照组为:0.870±0.027,P＜0.01)。其余两组bcr/abl mRNA表达水平均与对照组相近(BOR组为:0.858±0.015,IDA组为:0.844±0.029,对照组为:0.870±0.021,P＞0.05)。(5)100nmol/L硼替佐米和200nmol/L去甲氧柔红霉素联合作用K562细胞24小时后,K562细胞survivin和bcr/abl融合蛋白p210的相对表达水平成下降趋势。与阴性对照组相比,BOR+IDA两药联合应用组K562细胞survivin蛋白表达水平显著降低(BOR+IDA组为:0.371±0.025,对照组为:0.871±0.032,P＜0.05),其余两组survivin蛋白表达水平均与对照组相近(BOR组为:0.862±0.017,IDA组为:0.859±0.022,对照组为:0.871±0.032,P＞0.05)。与阴性对照组相比,BOR+IDA两药联合应用组p210蛋白表达水平亦显著下调(BOR+IDA组为:0.340±0.027,对照组为:0.865±0.021,P＜0.01)。其余两组p210蛋白表达水平均与对照组相近(BOR组为:0.838±0.019,IDA组为:0.8144±0.029,对照组为:0.865±0.021,P＞0.05)。四、结论(1)硼替佐米联合去甲氧柔红霉素可通过诱导凋亡的方式抑制白血病细胞株K562的增殖,两者联合对细胞的抑制作用比同剂量两药任一种单独使用时都显著增强。(2)硼替佐米联合去甲氧柔红霉素通过抑制survivin和bcr/abl基因的表达介导K562细胞发生凋亡可能是其作用机制之一。本研究提示硼替佐米联合去甲氧柔红霉素可作为临床治疗白血病的新方法。