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[目的]脊髓损伤(Spinal cord injuries,SCI)是一种高度致残性疾病,改善脊髓损伤后局部微环境促进损伤轴突再生和神经功能恢复已成为当前研究的重要方向。在脊髓损伤微环境中,神经营养因子是调节失衡微环境中多种病理生理过程的重要蛋白分子,其在保护细胞存活、改善炎症反应、促进轴突再生以及再髓鞘化过程中起着不可替代的作用。研究表明,雪旺细胞(Schwann cells,SCs)通过分泌BDNF、NT-3、NGF、FGF、GDNF等多种神经营养因子,协同作用于损伤后微环境,促进神经功能的恢复。前期研究证明,低强度脉冲超声(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)可以促进包括骨髓间充质干细胞、神经干细胞等细胞的神经营养因子的分泌。本研究旨在利用雪旺细胞分泌多样神经营养因子的特性,采用LIPUS体外激励雪旺细胞促进神经营养因子的分泌,通过移植LIPUS激励的雪旺细胞到脊髓损伤局部发挥神经保护作用及炎症调节作用,促进脊髓损伤大鼠轴突再生和运动功能恢复,为脊髓损伤的细胞移植联合疗法提供一种新的方法。[方法]本实验分为两个部分:(1)分离培养雪旺细胞及激活态雪旺细胞(预损伤7天);观测LIPUS激励的雪旺细胞(LIPUS-SCs)在神经营养因子分泌、细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性方面的改变,评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用;并与激活态雪旺细胞进行比较评价。(2)观察LIPUS-SCs细胞移植后,对损伤后微环境的改善作用及胶质瘢痕形成、轴突生长、再髓鞘化情况;探讨LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。体外实验部分:雪旺细胞及激活态雪旺细胞的分离、纯化及鉴定:从4周龄雌性Wistar大鼠的坐骨神经中分别提取雪旺细胞及激活态雪旺细胞(预损伤7天),使用双重酶消化和差速贴壁法对细胞进行培养纯化。S-100荧光染色鉴定细胞纯度。LIPUS激励系统的建立及实验分组:对纯化至第3代的雪旺细胞进行强度为50m W/cm~2,每次5min,连续3d的刺激。本部分研究分为三组:SC组、LIPUS-SCs组与ASCs组。LIPUS调节细胞生物学特性相关检测:采用ELISA法检测上清液中BDNF、NT-3、NGF的表达水平,探究LIPUS激励对于雪旺细胞神经营养因子表达的影响;CCK-8法检测雪旺细胞细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI双染色法检测雪旺细胞细胞凋亡情况;Transwell细胞迁移实验评价体外雪旺细胞细胞迁移情况。通过与ASCs组进行比较,综合评价LIPUS对雪旺细胞的调控作用效果。体内实验部分:动物实验模型及分组:60只成年雌性wistar大鼠,建立脊髓胸10(T10)节段脊髓损伤大鼠模型,分为4组:假手术组(Sham组)、损伤组(Injury组)、SCs移植组、LIPUS-SCs移植组。于脊髓损伤后第7天进行细胞移植治疗。大鼠运动功能恢复的行为学评价:从损伤后即刻开始,每周1次直到第8周实验结束,对各组大鼠进行BBB评分,观察其运动功能恢复情况。神经营养因子及炎症因子改变检测:ELISA法检测脊髓组织神经营养因子BDNF、NT-3、NGF;Western blot检测炎症因子IL-1β、IL-10的改变情况。综合评价LIPUS-SCs细胞移植对神经保护及炎性调节的作用。损伤后局部组织保留及炎症改变检测:在脊髓损伤后8周,取大鼠灌注脊髓组织用于HE染色以观察各组组织保留及炎症改变情况。轴突再生及星形胶质细胞活化情况检测:在脊髓损伤后8周,对脊髓纵切切片进行神经丝蛋白-200(NF200),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,DAPI染核。观察比较细胞移植后轴突生长,星形胶质细胞活化及胶质瘢痕形成情况。NRG1/ErbB信号通路改变检测:脊髓损伤后8周,Western blot法检测各组脊髓组织NRG1、ErbB2及MBP表达改变,明确LIPUS-SCs细胞移植通过NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤的作用机制。[结果]1.成功分离纯化了雪旺细胞及激活态雪旺细胞(预损伤7天),经S-100荧光染色鉴定,细胞纯度在95%以上。2.LIPUS激励促进雪旺细胞BDNF、NT-3、NGF的分泌表达:在接受LIPUS激励后,LIPUS-SCs组中BDNF、NT-3、NGF的表达与SCs组相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与ASCs组的神经营养因子分泌情况对比发现,达到与ASCs相似表达水平(P?0.05)。3.LIPUS激励提高雪旺细胞增殖活性:与未经LIPUS处理的SCs组相比(100%),LIPUS-SCs组的细胞活性明显提高(114.1%±1.754%),差异具有统计学意义(P<0.01)。同时,与ASCs组的细胞活性(112.5%±2.032%)对比发现,LIPUS-SCs组的细胞活性高于ASCs组(P<0.05)。4.LIPUS激励是一种安全的物理干预方式:Annexin V-FITC/PI双染色法发现,LIPUS激励后的雪旺细胞凋亡率比正常雪旺细胞低(2.003%±0.4888%vs.1.447%±0.1050%,P?0.05),LIPUS激励不会诱发细胞凋亡。5.LIPUS激励促进雪旺细胞迁移:通过Transwell细胞迁移实验发现,结晶紫染色的细胞数量在LIPUS-SCs组(53.50±4.203个/视野)显著高于SCs组(31±4.761个/视野),差异具有统计学意义(P<0.01)。在ASCs组也观察到较多的结晶紫染色细胞(57.50±6.557个/视野),与LIPUS-SCs组相比差异没有统计学意义(P?0.05)。6.LIPUS-SCs细胞移植促进大鼠运动功能恢复:在细胞移植后,到第8周大鼠后肢功能均有一定恢复;到第8周实验结束时,大鼠BBB评分在LIPUS-SCs移植组(15.667±0.578分)最高,SCs移植组(14±0分)次之,injury组(6.333±0.578分)最低,差异具有统计学意义(P<0.01)。7.LIPUS-SCs细胞移植促进脊髓组织局部营养因子表达并改善炎性反应:ELISA对损伤后2周脊髓损伤中神经营养因子的分泌进行检测,结果表明,LIPUS-SCs细胞移植组中脊髓局部BDNF、NT-3、NGF表达水平最高,优于SCs移植组,差异具有统计学意义(P<0.01)。LIPUS-SCs细胞移植还有很好的炎性调节作用,其可以抑制促炎症因子IL-1β过度表达,促进抑炎因子IL-10的表达上升。8.LIPUS-SCs细胞移植促进神经功能恢复:HE染色显示,细胞移植尤其是LIPUS-SCs细胞移植有助于损伤后组织形态的保留,减少脊髓空洞形成及炎性细胞的浸润;NF200/GFAP免疫荧光双标染色显示,在SCs及LIPUS-SCs细胞移植组中,和Injury组相比,观察到更多的NF200标记的轴突生长,而GFAP免疫荧光强度明显低于Injury组(P<0.05);且LIPUS-SCs移植组中NF200阳性轴突的数量及平均长度明显多于SCs移植组(P<0.05)。9.LIPUS-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤:通过Western blot对NRG1/ErbB信号通路关键蛋白进行检测,结果显示,LIPUS-SCs组中,NRG1,ErbB2及MBP的蛋白表达水平较SCs组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.低强度脉冲超声激励雪旺细胞,可以显著提高营养因子BDNF、NT-3和NGF的表达;促进细胞迁移能力及细胞增殖活性;且不会诱发细胞凋亡,是一种安全的物理干预方式。2.与预损伤获得的激活态雪旺细胞相比,LIPUS-SCs可以达到与之相似的营养因子分泌及细胞迁移能力,为雪旺细胞的高效获取提供了一种新的方法。3.LIPUS-SCs细胞移植有利于损伤组织的保留,可以有效促进局部营养因子分泌,调节炎症反应,抑制反应性星形胶质细胞增生,有助于脊髓损伤后轴突再生及轴突生长,获得更好的运动功能恢复。4.LIPUs-SCs细胞移植通过激活NRG1/ErbB信号通路促进轴突再生修复脊髓损伤。