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研究背景:心肌纤维化(Myocardial fibrosis)是全球范围内的重要公共问题之一,因为其参与了几乎所有的心血管疾病的发生发展。目前心肌纤维化机制尚未完全阐明,心脏纤维化治疗仍缺乏有效策略。继续探索心肌纤维化机制并寻找合适干预靶点对心血管疾病的治疗尤为重要。TGF-β/Smad信号通路是目前心肌纤维化中研究最为经典的信号通路,但遗憾的是不能直接靶向TGF-β/Smad通路来治疗心肌纤维化。研究证实通过其他干预靶点能有效抑制TGF-β/Smad通路的激活并避免影响其生理调节功能。其中AMPK被证实可通过抑制TGF-β/Smad3/p38MAPK通路激活来调控心肌纤维化。CaMKK2是钙调激酶家族成员,研究表明细胞内钙离子激活CaMKK2后可特异性调控AMPK,发挥多种重要的生物学功能。少数研究提示CaMKK2可能是参与心脏病理生理的重要激酶,但其在心脏中的直接研究还未见报道。研究目的:验证CaMKK2在心肌纤维化中的作用;阐明其参与心肌纤维化调控的作用机制;同时结合实验数据讨论其是否可作为心肌纤维化的干预靶点。研究方案与方法:第一部分:动物实验:8-10周龄,体重23.5-25.5之间的健康雄性C57BL6小鼠。主动脉缩窄术(aortic banding,AB)和Ang Ⅱ持续泵入建立心肌纤维化模型。AB术后第3天,1W,2W,4W和8W取材;AngⅡ泵入组在第3天,1W和2W时取材。蛋白印迹来检测心脏中CaMKK2表达。细胞实验:分离大、小鼠的心肌细胞与成纤维细胞,分别检测基础状态及肾上腺素(PE,50μM)作用5 min,30min,1h,2h,3h,6h后CAMKK2表达。细胞爬片免疫荧光检测CAMKK2表达。人体标本:收集扩张型心肌病心衰患者和未配型成功供体心脏标本。免疫荧光检测组织中CAMKK2的表达与定位,比较CaMKK2表达差异。第二部分:动物实验:8-10周龄,体重23.5-24.5之间的健康雄性C57BL6和CaMKK2-/-小鼠。AngⅡ持续泵入建立心肌纤维化模型,第1W和2W时超声检测小鼠心功能;AB术建立心肌纤维化模型,第4W和8W时超声检测小鼠心功能;断椎处死小鼠,快速取出心脏并称重,记录小鼠肺重与体重;收集的心脏随机分为两组,一组用于HE染色、PSR染色以及免疫组化染色等病理染色;另一组心脏行分子生物学检测。第三部分:随机选取C57BL6和CaMKK2-/-(AngⅡ持续泵入7天)小鼠左心室各三例。提取总RNA,反转录建立DNA文库后利用Illumina NextSeq 500上机检测。采用DEseq(version 1.18.0)对基因表达进行差异分析,设定(fold change>2,p<0.05);采用R语言ggplots 2软件包绘制差异基因的火山图;采用R语言Pheatmap软件包对基因和样本进行双向聚类分析;GO功能富集分析差异基因显著富集功能条目和相关生物学功能;统计各个KEGG Pathway不同层级上包含的差异表达基因数目,确定差异表达基因主要参与的代谢通路。RT-PCR用来检验测试结果的一致性。第四部分:动物实验:取第二部分收集的心脏组织westerb-blot检测相关信号通路变化;细胞实验:选取八周龄C57BL6和CaMKK2-/-小鼠,分离左室成纤维细胞。流式检测a-SMA表达;分时段培养计算细胞增殖速度;细胞划痕实验观察各组成纤维细胞增殖与迁移能力;通过加入AICAR、雷帕霉腺和病毒过表达P21来证实CaMKK2调控的信号通路。结果:第一部分:1、AngⅡ泵入后第3天CaMKK2表达达峰值,七天以后降至正常水平下;AB术后,CaMKK2在第七天达峰值,两周后降至正常水平下;2、荧光共定位提示CaMKK2位于心肌组织的间质,心衰组织中表达下调;3、心肌细胞中CaMKK2基础表达量较少,给予PE刺激后,表达改变无统计学差异;心脏成纤维细胞中CaMKK2的表达量明显较心肌细胞多,PE作用后呈显著性增加。第二部分:1、给予AngⅡ 1w和2w,AB术后4w和8W,CaMKK2-/-组小鼠心重,心重/体重比和心重/腔骨长度比较C57BL6组显著增加;2、超声结果提示AngⅡ 1w和2w后,AB术后4w和8W,CaMKK2-/-小鼠心功能较C57BL6组显著恶化;3、与C57BL6组相比,CaMKK2-/-小鼠心肌细胞横截面积显著增大,纤维化明显加重,心肌间质和血管周围a-SMA显著增加;4、与C57BL6组相比,CaMKK2-/-小鼠组ANP和BNP表达显著增加;同时collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达显著升高;第三部分:1、差异大于两倍的基因中,CaMKK2-/-小鼠心脏组织中234个基因表达上调,79个基因表达下调;2、Gene Ontology富集分析共计292个Term存在显著性差异,前二十个显著改变Term中大都与细胞周期相关;KEGG差异表达基因通路层级分析发现变化最显著的前二十通路大都与细胞周期相关。3、选择CaMKK2-/-小鼠测序结果中高表达基因,RT-PCR验证结果与测序结果基本一致。第四部分:1、CaMKK2-/-小鼠心脏成纤维细胞在重构刺激因子作用下,增殖、分化和胶原分泌能力显著增强;2、CaMKK2-/-小鼠心脏组织和成纤维细胞中AMPKα1活性降低,mTOR信号通路激活,p53/p21信号通路抑制;AMPKα激动剂AICAR逆转CaMKK2缺失后改变的信号通路;3、CaMKK2-/-小鼠心脏成纤维细胞中,雷帕霉素或腺病毒过表达p21均显著抑制心脏成纤细胞增殖、分化与胶原分泌,p21作用强于雷帕霉素;同时加入雷帕霉素和导入p21则完全抑制心脏成纤细胞增殖、分化与胶原分泌。结论:CaMKK2表达于人体、大鼠和小鼠心脏成纤维细胞中;CaMKK2缺失加重AngⅡ或AB诱导的小鼠心肌重构特别是加重心脏纤维化;二代测序结合实验证实,CaMKK2通过激活AMPKα1稳定P53和P21同时抑制mTORC1的磷酸化。成纤维细胞特异性CaMKK2调控有望成为心脏纤维化的治疗靶点。