发达国家的流行病学研究显示,高饱和脂肪酸、高脂与高热量的摄入与心血管疾病的死亡率呈正相关。然而,低心血管病事件却在高脂肪摄入的法国人中出现。这种现象被称为“法兰西”悖论,考虑可能与法国人高红酒摄入相关。许多研究表明:红酒的主要成分之一白藜芦醇,在“法兰西悖论”中起到重要作用,但却不能完全解释这一现象。鞣酸(Tannic Acid,TA)是植物中广泛存在的多酚类复合物,红葡萄酒中的含量明显高于白酒。最近研究显示:TA具有强大的抗氧化,清除氧自由基的能力,抑制脂肪酸氧化,降低甘油三酯和胆固醇等作用。既往研究发现具有抗氧化特性的药用植物存在心脏保护作用。因此,我们推测除了白藜芦醇,TA的心脏保护作用有助于进一步解释“法兰西悖论”。过去数十年心血管疾病研究的进展之一主要体现在对心血管事件链的深刻认识。这些认识进展使患者在心血管事件链的不同阶段如多种心血管疾病风险因素,心血管事件高发,终末期心衰采取不同干预措施成为可能。通过阻断心血管事件链,对心血管事件链的多点干预治疗,可预防或控制心血管疾病进展,提高患者生活质量,延长患者生命。目前通过改良生活习惯,控制风险因素,优化饮食结构,针对病因治疗,应用血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACE),血管紧张素酶受体拮抗剂(Angiotensin Receptor Blocker,ARB),倍他受体阻滞剂(β-receptor antagonist,β-B),螺内酯等药物已明显提高了心力衰竭的救治水平和救治效果。通过上述综合治疗,心力衰竭已取得明显成绩,挽救了大量患者生命。然而中国人口巨大,医疗费用占用过多,只有加强预防才能实现心血管疾病的拐点。通过对TA的深入研究希望能够逐渐阐明TA的心血管保护作用,为预防心血管疾病和今后的食品工业提供一些借鉴作用。TA是红酒中的主要成分之一,是一种多酚类复合物,各种植物特别是蔬菜,水果中含量丰富,作为食物和饮料被人们广泛消费。食品工业将其广泛用于防腐剂和安全的食品添加剂。鞣酸的分子式是C76H52O46(图1),由五个酯酰基和一个糖基构成。研究表明TA具有抗基因突变,抗癌和抗菌作用,而TA对高脂饮食的心血管保护作用尚未阐明,可能与其抗氧化,清除自由基,抑制脂蛋白氧化,降低血浆甘油三酯和胆固醇水平和其它一些尚未发现的功能有关。因此本研究希望能够探讨TA的心血管保护作用和TA心血管保护作用的可能机制。综上所述,近年来除白藜芦醇外,红酒其它成分的心脏保护作用逐渐引起人们关注。TA是红酒的主要成分之一,然而,TA对异丙肾上腺素所致心脏损伤的保护作用及其机制的研究未见报道。本研究论文主要从分子生物学、形态学、细胞学、免疫组化等深入探讨TA对异丙肾上腺素心脏损伤的保护作用及其机制,主要包括以下内容:1)鞣酸对异丙肾上腺素所致大鼠心室重构的保护作用及其机制研究;2)鞣酸对异丙肾上腺素所致心室重构大鼠氧化应激、炎症变化和血脂不良改变的影响;3)鞣酸对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌损伤的保护作用及机制研究。第一部分鞣酸对异丙肾上腺素所致大鼠心室重构的保护作用及其机制研究目的:心室重构是心血管疾病最重要的靶器官损害之一。本文通过ISO所致大鼠心室重构模型,研究TA对心室重构的影响,及其可能的保护机制。方法:将50只实验大鼠随机分为5组:对照组、异丙肾上腺素组(Isoprenaline,ISO)、鞣酸低剂量组(Little-dose tannic acid,L-TA)、鞣酸中剂量组(Middle-dose tannic acid,M-TA)和鞣酸高剂量组(High-dose tannic acid,H-TA),每组10只。实验组给予异丙肾上腺素(ISO)(5mg/kg/d)分三次皮下注射连续7天制备大鼠心室重构(Cardiac remodeling,CR)模型;空白对照组大鼠皮下注射相应体积的0.9%Na CI。ISO皮下注射1周后,TA干预组分别灌胃给予L-TA、M-TA、H-TA,持续两周。ISO组和空白对照组均灌胃给予等量0.9%Na CI。结果:1 TA对ISO致心室重构大鼠心脏功能的影响ISO连续皮下注射7d,大鼠-dp/dtmax和LVEDP的数值明显高于空白对照组,而+dp/dtmax明显低于空白对照组,HR和LVSP变化不明显。L-TA、M-TA和H-TA均能降低大鼠心脏-dp/dtmax和LVEDP的数值;同时提高+dp/dtmax,与ISO组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);研究显示:TA的效果有剂量依赖性。2 TA对ISO致心室重构大鼠心脏重量、左室重量、心重指数(HW/BW and LVW/BW)的影响给予ISO连续皮下注射7d可引起大鼠心脏明显增大,HW、LVW明显增加,以及HW/BW、LVW/BW两指数明显增加,较对照组差异有统计学意义(P<0.05)(图1A)。TA(20、40mg及60mg/kg/d)实验治疗2周后,能明显抑制心脏的肥大,HW/BW、LVW/BW两指数明显下降,较ISO组差异有统计学意义(P﹤0.05)。3 TA对ISO所致心室重构大鼠CVF和PVCA的影响HE和VG染色显示:大鼠组织标本在光镜下观察,HE染色可见ISO使心肌纤维纵径和CSA明显增加较对照组有统计学意义(P<0.05)。VG染色显示:心肌间质胶原容积分数较对照组明显增加,有统计学差异(P<0.05)。显示心肌细胞呈黄色,胶原纤维呈红色。正常对照组显示:心肌胶原纤维含量较少,心肌纤维丰富,心肌间质CVF和和血管周围PVCA比例较低。ISO组心肌胶原纤维明显增多,心肌纤维减少,ISO组心肌间质CVF和血管周围PVCA明显增高。通过心肌胶原含量的半定量分析,ISO组心肌间质CVF和血管周围PVCA与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01);ISO致心室重构大鼠,经过TA(20、40及60 mg·kg-1)2周处理,VG染色可见心肌纤维明显增加,胶原纤维减少,心肌间质CVF和血管周围PVCA明显降低与ISO组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。4 TA对ISO所致心室重构大鼠心肌组织中羟脯氨酸(Hyp)和血清中脑钠肽(BNP)含量的影响从研究结果可见,与Contral组相比,ISO组的大鼠心肌组织中Hyp含量明显增加(P<0.01)。而经L-TA,M-TA,H-TA实验治疗2周后,各处理组的大鼠心肌组织中Hyp含量明显减少,与ISO组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结果所示,ISO组的大鼠血清中BNP含量较control组明显升高(P<0.01)。给予L-TA治疗2周后,与ISO组比较,大鼠血清中BNP含量有降低的趋势,差异没有统计学意义(P>0.05);给予M-TA、H-T治疗2周后,大鼠血清中BNP含量有降低的趋势明显(P<0.05),差异有统计学意义。5 TA对ISO所致心室重构大鼠心肌中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB的影响Western-blot结果显示,与Control组比较,ISO组的大鼠心肌组织中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB明显增加,有统计学意义(P<0.05)。给予TA 20,40,60mg/kg治疗2周后,可以抑制大鼠心肌组织中Bax/Bcl-2比值、Caspase-3和NF-κB表达水平,与ISO组比较,L-TA、M-TA(P<0.05)、H-TA(P<0.01)差异有统计学意义。结论:TA可剂量依赖性的改善ISO致心脏重构大鼠的血流动力学参数,降低心脏肥厚参数,减少心肌形态学变化,抑制心肌纤维化,减少Hyp和BNP含量;其可能机制是下调Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB水平。第二部分鞣酸对异丙肾上腺素所致心室重构大鼠氧化应激、炎症变化和血脂不良改变的影响目的:研究TA对ISO致心室重构大鼠氧化应激、炎症变化和血脂不良代谢的影响方法:分组及给药方法同“第一部分”。结果:1 TA对ISO致心室重构大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA浓度影响研究发现:ISO组与对照组相比,MDA水平明显增高(P<0.01),CAT的水平明显降低(P<0.01);SOD和GSH-Px活性明显下降(P<0.05,P<0.01)。经过2周L-TA、M-TA、H-TA处理,MDA水平明显降低(P<0.01),而CAT水平明显提高(P<0.01);L-TA SOD活性有增加趋势,较ISO增加无统计学意义(P>0.05);M-TA组SOD活性增加明显(P<0.05);而H-TA组SOD活性增加更加明显(P<0.01)。TA各剂量组处理GSH-Px活性均明显增加(P<0.01)。2 TA对ISO致心室重构大鼠心室组织中IL-1β、TNF-α、c-fos,c-jun的表达的影响炎症因子IL-1β、TNF-α、c-fos,c-jun在正常细胞中表达水平非常低,表达增加与细胞损伤和炎症反应明显相关。ISO致心室重构大鼠模型显示IL-1β、TNF-α、c-fos,c-jun表达明显增加(P<0.01)。经过TA 2周处理后,IL-1β、TNF-α、c-fos,c-jun表达较ISO组明显下降,有统计学意义(P<0.01)。3 TA对ISO致心室重构大鼠血清中CPR水平影响对照组CPR浓度较低,ISO组CPR浓度明显增加。经过TA处理后CPR浓度明显降低较对照组有统计学意义(P<0.05)。研究同时表明:TA降低CPR浓度具有剂量依赖性。4 TA对ISO致心室重构大鼠血脂的干预作用ISO组大鼠血清中TC、LDL、VLDL、TG游离脂肪酸、磷脂等血脂水平明显增加,而HDL水平明显降低,较对照组差异有统计。经过TA处理后,TC、LDL、VLDL、TG游离脂肪酸、磷脂等血脂水平明显降低,HDL水平明显升高(P<0.01),但20 mg/kg低剂量TA组TC,HDL,VLDL,TG游离脂肪酸和磷脂有一定变化,与ISO组相比没有统计学意义(P>0.05)。结论:结果表明:TA抑制ISO致心脏重构大鼠的氧化应激水平、炎症表达、调节血脂代谢,对心肌细胞起保护作用;其可能机制是下调IL-1β、TNF-α、c-fos,c-jun等炎症因子的表达。第三部分鞣酸对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌损伤的保护作用及机制研究目的:测定异丙肾上腺素诱发急性心肌损伤大鼠的心电图、血流动力学指标、心肌酶、内皮素-1与NO浓度,c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表达;探讨TA对异丙肾上腺素所致大鼠心肌损伤的保护作用及机制。方法:将50只雄性SD大鼠,体重(180-220g),由河北医科大学试验动物中心提供。实验大鼠随机分为5组:对照组、ISO组、维拉帕米组(Verapamil,VER)、L-TA组(20mg/kg/d)和H-TA(40mg/kg/d)组。对照组和ISO组腹腔注射(Intraperitoneally,i.p)0.9%Na CI(0.1mg/kg/d),VER组给予维拉帕米2mg/kg/d腹腔注射,低、高剂量组,大鼠分别给予TA(20mg/kg/d,40mg/kg/d)灌胃进行预处理。预处理7天后,试验组予ISO 8mg/kg腹腔注射;对照组接受等容积的0.9%Na CI腹腔注射,腹腔注射6小时后进行相关参数检测。结果:1 TA对ISO致急性心肌损伤大鼠心电图和心脏血流动力学的影响ISO组与对照组比较心电图ST段明显抬高,血流动力学参数:心率、LVEDP明显增加,±dp/dtmax变化幅度降低;而TA与VER组各项参数恢复接近正常水平,且体现剂量依赖性。注射ISO之前,预处理各组较对照组各项参数统计学无差异。2 TA对ISO致急性心肌损伤大鼠心肌酶和内皮功能的影响对照组和试验组血清CK、CK-MB、LDH、ET-1和NO发生明显变化。ISO大剂量腹腔注射后心肌酶各项指标明显增加(CK增加53.61%,CK-MB增加79.05%,LDH增加42.56%),与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。经过TA和VER预处理1周,心肌酶各项指标明显降低(P<0.05,P<0.01)接近正常水平。ISO处理后ET-1水平同样出现明显增高(P<0.01),经过TA和VER预处理1周后各组ET-1水平明显降低。相反NO水平在ISO组明显降低,经过TA和VER预处理明显增加(P<0.01),接近正常水平。3 TA对ISO诱发急性心肌损伤大鼠的心肌组织病理形态学分析各组大鼠H&E染色切片的典型表现各不相同。正常对照组未见心肌组织坏死、水肿和炎症,而ISO组可见波状纤维,心肌纤维丢失,广泛的心肌坏死,炎症细胞浸润,明显心肌细胞水肿和空泡化。TA低剂量、高剂量组和VER组可见心肌细胞炎症细胞浸润,心肌坏死和水肿较对照组明显降低。而且进展性的心肌空泡化较ISO组明显减弱。4 TA对ISO诱发急性心肌损伤大鼠的心肌组织中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA浓度影响ISO处理组较对照组MDA水平明显增高(112.41%,P<0.01),CAT明显下降(48.87%,P<0.01)。ISO致急性心肌损伤大鼠的心肌组织中组SOD下降(61.77%,P<0.01)和GSH-Px的活性也明显降低(51.70%,P<0.01)。与ISO组相比,经过不同剂量TA和VER预处理各项参数接近正常水平,与ISO有统计学差异。5 TA对ISO致急性心肌损伤大鼠心肌组织中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表达的影响大鼠心肌组织中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、NF-κB、caspase-3和-9蛋白表达与细胞损伤、炎症和细胞凋亡相关,在正常对照组相关蛋白表达较低(Fig.5,Fig.6和Fig.7)。经过ISO腹腔注射导致急性心肌损伤可见上述蛋白在大鼠心肌组织中的表达明显增加较对照组有明显统计学意义(P<0.01)。经过TA不同剂量预处理和VER预处理上述蛋白表达明显下调,较ISO有明显统计学意义(P<0.01)。结论:研究表明:TA可改善ISO致急性心肌损伤大鼠的心电图ST改变和血流动力学参数,抑制氧化应激反应,降低心肌酶浓度;其主要机制可能与下调c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、NF-κB、caspase-3和-9表达,降低ET-1的分泌、增加NO含量,改善血管内皮功能有关。