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纳米二氧化钛(titanium dioxide，TiO2)已经被广泛应用于许多与人们日常生活紧密相关的领域。由于纳米TiO2具有纳米材料独特的理化性质，进入机体后可能引起与常规尺寸二氧化钛不一样的生物学效应，其对人类健康的潜在影响不容忽视。目前国内外纳米TiO2毒性研究主要集中在对呼吸系统和皮肤的影响，而作为生物体抵御外界外来化合物的第一道防线-免疫系统，纳米TiO2对其毒性作用的研究极少。MicroRNAs(miRNAs)是一类长约21-22个核苷酸的高度保守的非编码小RNA，主要通过抑制蛋白编码基因的转录或诱导其mRNA降解调控蛋白表达，从而进一步调节细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程，在生长发育及疾病的发生发展中起着重要的作用，目前已成为阐明环境、基因与疾病之间联系的热点研究领域之一。已有研究表明环境颗粒物暴露可引起miRNAs的变化，但目前关于纳米材料对miRNAs调控的研究报道非常少见。纳米材料进入细胞之后，如何引起miRNAs调控改变，这些改变与纳米粒子对机体产生损伤之间的关系如何等，迫切需要研究来证实。 本研究以大鼠为研究对象，检测纳米TiO2暴露后对系统免疫的影响，探讨纳米TiO2对机体的免疫毒性，以巨噬细胞为研究对象，应用高通量测序技术，检测纳米TiO2暴露后产生的的miRNAs表达改变，筛选免疫相关的miRNAs，并通过生物信息学软件对差异表达miRNAs进行调控通路分析，在此基础上对miR-350的生物学功能及靶基因调控进行研究，较为系统的探讨miRNAs在纳米TiO2暴露过程中的作用和可能机制。为纳米TiO2免疫毒理学安全性评价提供新的思路和依据。 一、纳米TiO2对大鼠的免疫毒性研究 将40只雄性SD大鼠随机分为低、中和高(分别为0.5、4和32 mg/kg)三个纳米染毒组，对照组（生理盐水）和微米染毒组(32 mg/kg)。采用支气管滴注，每周染毒2次，实验共持续28天。实验结束后处死大鼠，收集免疫脏器和外周血，测定免疫病理及免疫功能相关指标，包括组织病理学、脾脏T、B淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、外周血淋巴细胞表型和细胞因子表达。结果显示，高剂量纳米TiO2支气管滴注暴露可引起轻微的脾脏充血和在颈部、腋下淋巴结中蓄积，并引发脾脏T、B淋巴细胞增殖能力增加、NK细胞活性增强和外周血B细胞数增加，结果提示呼吸道暴露纳米TiO2可刺激机体产生系统免疫应答。 二、纳米TiO2对巨噬细胞的miRNAs表达谱影响和生物信息学分析 应用100μg/mL纳米TiO2对巨噬细胞RAW264.7进行染毒，24 h后提取RNA，应用Hi-seq2000高通量测序分析系统进行全基因组的miRNAs测序分析。测序结果显示，与对照组相比，纳米TiO2暴露后使RAW264.7细胞miRNAs表达谱发生了明显改变，共有140个miRNAs发生差异表达，其中131个miRNAs表达上调，9个miRNAs表达下调，miRNAs总体上调的幅度高于下调的幅度。对miR-350和miR-29b进行RT-qPCR分析，结果显示RT-qPCR与测序结果一致。进一步应用DIANA-mirPath及KEGG数据库，对筛选出的差异表达miRNAs进行信号通路分析，结果显示，差异表达miRNAs的信号通路主要集中在Focaladhesion、Axon guidance、MAPK、Adherens junction、Wnt等与细胞通讯和信号转导相关的通路上，并可能通过对T cell receptor、B cell receptor、Natural killer cellmediated cytotoxicity等免疫相关信号通路的调节在纳米TiO2引发机体免疫反应中发挥重要作用。对miR-350信号通路和靶基因预测分析显示，miR-350可能通过对PIK3R3基因的调控参与T cell receptor、B cell receptor、Natural killer cellmediated cytotoxicity信号通路的调控。 三、miR-350对巨噬细胞的生物学功能及靶基因调控研究 通过转染miR-350mimic上调RAW264.7细胞中miR-350的表达水平，应用MTT法和流式细胞仪分别检测上调miR-350对RAW264.7细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，结果显示，与阴性对照组相比，转染组细胞的凋亡率明显增强，但细胞增殖和周期无显著性改变。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测上调miR-350对PIK3R3基因的mRNA和蛋白表达水平的影响，结果显示，与阴性对照组相比，转染组细胞PIK3R3基因的蛋白表达显著下降，但PIK3R3基因的mRNA表达无显著性改变。结果提示miR-350可能通过对PIK3R3基因负向调控促进RAW264.7细胞的凋亡。 综上所述，本研究通过检测纳米TiO2暴露后对大鼠免疫系统的影响探讨纳米TiO2对机体的免疫毒性，结果提示呼吸道暴露纳米TiO2可刺激机体产生系统免疫应答。对纳米TiO2暴露后巨噬细胞miRNAs表达谱进行分析，筛选出140个差异表达miRNA，生物信息学分析结果提示这些miRNA主要参与了细胞通讯和免疫相关等信号转导通路的调控。对miR-350的生物功能和靶基因调控研究显示，miR-350可能通过对PIK3R3基因负向调控促进RAW264.7细胞的凋亡。研究为进一步了解纳米TiO2暴露对机体免疫功能的影响及其可能的机制提供理论依据。