蛋白的聚集会导致蛋白空间构型发生变化,进而导致蛋白质丧失正常的生物学功能,聚集形成的纤维体会沉积在细胞中,引起细胞功能障碍,最终导致组织器官发生病变,引发各种疾病,如老年痴呆症、Ⅱ型糖尿病、帕金森综合症、阿尔兹海默症等。研究药物分子对蛋白淀粉样纤维化过程的抑制作用,对疾病的预防和治疗以及新药的开发研究具有重要意义。研究表明,天然的酚类化合物具有潜在的抑制蛋白纤维化的作用。黄酮类化合物是一类广泛存在自然界的天然酚类物质,但目前关于此类化合物对蛋白聚集抑制作用的研究主要集中于儿茶酚类黄酮化合物的研究。溶菌酶是第一种作为疾病标志物的蛋白质,是己知能够形成淀粉样纤维的球形蛋白经典模型,因此,本研究选择了18种结构不同的非儿茶酚类黄酮,以鸡蛋清溶菌酶为体外研究模型,通过条件的考察,建立了溶菌酶聚集纤维化研究模型,在建立的模型的基础上,利用8-苯胺基-1-奈磺酸(8-Anilion-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、硫黄素T(Thioflavine T,ThT)、刚果红探针技术,圆二色谱(Cirular Dichrosin,CD),透射电镜等研究了上述黄酮类化合物对溶菌酶纤维化过程中疏水区暴露、β片层折叠增加过程的抑制作用;通过分子对接技术,对上述黄酮类化合物对溶菌酶聚集的抑制作用机理进行了初步探讨,所获结果对于我们探究黄酮类化合物蛋白聚集抑制剂的筛选和分子机理探讨提供了有益的参考和依据。具体内容如下:1.溶菌酶自聚集纤维化过程体系的构建及表征以ThT为荧光探针,考察了不同pH、温度、有机溶剂浓度以及放置时间对溶菌酶聚集情况的影响,确定了溶菌酶自聚集纤维化过程研究的实验模型,研究表明:50μM鸡蛋清溶菌酶在含0.5%的DMSO pH 2.0的甘氨酸-HCl缓冲溶液中,恒温温度65℃下,放置16天,可以完成自聚集,成长为淀粉样纤维,生长曲线呈S型,成长过程是一个成核—纤维延长—纤维成熟的动力学过程。在确定的条件下,通过ANS荧光探针法、刚果红紫外探针法、CD光谱以及TEM检测了溶菌酶纤维化过程中疏水区域暴露和β片层折叠结构的变化情况,结果显示随着溶菌酶纤维化过程的加剧,其二级结构发生明显变化,α螺旋结构逐渐转变为β片层折叠结构,疏水区域暴露加剧,由均一的溶液逐渐成长为长的丝状纤维。2.黄酮类化合物对溶菌酶自聚集纤维化过程的影响研究在相同实验条件下,将与溶菌酶不同浓度比例(1:1,1:0.5,1:0.2)的黄酮类化合物加入溶菌酶样品中一起孵育,采用ThT、ANS荧光法、刚果红吸收法、CD、透射电子显微镜检测黄酮类化合物对溶菌酶聚集的影响。结果显示,加入黄酮类化合物的溶菌酶溶液,与成熟纤维的ThT荧光强度、ANS荧光强度以及刚果红吸收强度相比,都有不同程度的降低,降低的程度与加入的黄酮化合物的浓度呈正相关;CD光谱显示,加入黄酮类化合物后,聚集过程中β片层结构的吸收逐渐减小,α螺旋结构吸收逐渐增多;TEM形貌观察显示,加入黄酮类化合物后的溶菌酶纤维变短,变细。在这18种黄酮类化合物中;葛根素、柚皮素、槐角苷、槲皮素,水飞蓟宾、柚皮苷、白杨素、黄芩苷、黄芩素、木犀草素都显示出了较强的抑制溶菌酶聚集纤维化的作用,在1:1浓度比例下,对溶菌酶聚集过程的疏水区暴露及β片层增多的抑制率均达到70%以上,显示了较强的抑制作用。3.分子对接法研究黄酮类化合物与溶菌酶的相互作用由上述的实验结果表明,黄酮类化合物对溶菌酶聚集的抑制作用主要发生在溶菌酶纤维化形成的前期,意味着黄酮类化合物对溶菌酶的聚集抑制主要来源于黄酮类化合物与溶菌酶单体之间的相互作用,因此,我们以2LYZ的三维空间结构作为模型蛋白,用Autodock 4.0软件对溶菌酶与黄酮类化合物分子进行分子对接,分子对接的研究结果显示,黄酮类化合物与溶菌酶活性位点的氨基酸残基之间形成了氢键、范德华力;溶菌酶疏水腔内的疏水性氨基酸与黄酮类化合物可以形成疏水作用;并且黄酮化合物的芳香环与溶菌酶活性位点的芳香氨基酸残基处于平行位置时候可以形成π-π堆叠作用;这些作用力都可以维持溶菌酶构象的稳定性,进而达到抑制溶菌酶聚集的目的。