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水杨酸(salicylic acid,SA)又称邻羟基苯甲酸,在植物逆境中作为重要的免疫信号分子被广泛研究。近年来研究发现,外源添加SA影响植物的生长、代谢。灵芝作为大型药用真菌,富含较高的营养成分和极高的保健作用,在我国有着悠久的应用历史。灵芝三萜作为灵芝次级代谢产物之一,具有抗氧化、抗病毒等活性。SA在植物中能够诱导次级代谢产物的产生,然而尚未有SA对真菌的次级代谢的生物合成的研究。本研究以灵芝为研究材料,外源添加SA诱导灵芝三萜的显著升高,并发现ROS信号参与SA诱导的灵芝三萜的合成。利用NADPH氧化酶的抑制剂二碘基苯(DPI)和NOX沉默转化子,并用外源添加SA,测定ROS含量,初步解析ROS产生的来源,并用Clark氧电极对线粒体呼吸速率的测定和对线粒体复合物Ⅲ酶活的测定,进一步解析了 SA诱导ROS产生的另一个来源于线粒体。取得了以下主要结论:1.外源添加SA能够显著诱导灵芝三萜的生物合成,并发现SA对灵芝三萜的诱导效应呈现出剂量效应和时间效应。通过RSM优化SA处理浓度和诱导时间,得到了 SA最佳诱导条件为(233.02 μM,26.40h)229.03 μg/100 mg,灵芝三萜显著提高了66.38%。同时也发现SA对三萜合成关键基因(hmgr,osc,sqs)、中间代谢产物Lano和SQ的有诱导作用。2.外源SA诱导胞内ROS积累,同时检测到SA能够诱导部分清除ROS相关酶活以及相关基因表达量提高,ROS清除剂可以有效降低SA诱导的灵芝三萜的含量和ROS的含量,同时也证实了 SA对三萜合成关键基因(hmgr,osc,sqs)、中间代谢产物Lano和SQ的影响均受ROS调控,说明SA诱导灵芝三萜的合成受ROS信号调控。3.为探究ROS的来源,添加NOX抑制剂或使用Nox沉默转化子后SA诱导的胞内ROS的含量下降25-30%,并发现对灵芝三萜含量的影响具有一致性,对SA诱导ROS相关酶活性以及ROS系统中关键基因量在NOX被抑制后有一定缓解;说明NOX参与SA诱导ROS产生以及在SA诱导的相关表型中起一定作用。4.进一步对ROS的来源研究发现,SA处理后能引起线粒体ROS的迅速产生,由此推测SA可能对线粒体电子呼吸传递链有影响,通过线粒体抑制剂使用考察对灵芝三萜的影响以及分离灵芝菌株线粒体运用Clark氧电极测定不同处理条件下对呼吸速率的影响,并对线粒体复合物Ⅲ的酶活进行测定,发现SA抑制线粒体复合物Ⅲ的酶活近45-50%且抑制效果不能被还原剂消除,同时对线粒体复合物Ⅲ转录水平检测发现,和酶活变化趋势具有一致性。说明SA诱导ROS产生的另一来源,源于抑制线粒体复合物Ⅲ的酶活。综上所述:SA诱导ROS信号参与灵芝三萜的生物合成,其中NOX是ROS产生的来源之一,SA通过抑制线粒体复合物Ⅲ的酶活,引起线粒体ROS的产生,是ROS产生的另外一个来源之一。本研究结果为以后阐释SA诱导ROS信号参与灵芝三萜的生物合成提供理论依据。