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DEAD-box家族蛋白是一类数量众多、结构高度保守的RNA解旋酶,参与多种生物学过程。近年来,大量的研究发现,DEAD-box RNA解旋酶还参与天然免疫调控,尤其在调控干扰素（Interferon,IFN）产生方面发挥重要作用,但不同的DEAD-box RNA解旋酶对IFN的产生及其下游信号通路的调控作用不同。本实验室前期研究发现猪源DDX18（p DDX18）和人源DDX18（h DDX18）与转录因子IRF3相互作用并抑制IRF3介导的IFN-β启动子激活,从而抑制IFN-β产生,从细胞水平证实DDX18具有调控干扰素的功能。为了从机体水平进一步证实DDX18对干扰素的调控作用,本研究首次在鼠源细胞上验证了鼠源DDX18（mDDX18）负调控IFN-β产生,并在DDX18+/-小鼠体内评价了mDDX18敲低对病毒感染诱导IFN及IFN刺激基因（ISG）表达和对HSV-1及VSV增殖的影响。主要研究内容与结果如下:1. 干扰mDDX18促进病毒诱导的IFN-β产生采用特异性si RNA干扰鼠巨噬细胞RAW264.7内源性DDX18的表达,分析干扰mDDX18表达后对病毒诱导的IFN及ISG表达的影响。结果显示:干扰mDDX18表达显著上调仙台病毒（Sendai virus,Se V）、人单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）和水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）诱导的IFN-βmRNA水平以及IFN-β下游信号通路中ISG15、ISG56的表达,证实mDDX18具有负调控IFN-β产生的特性。2. mDDX18抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性从RAW264.7细胞中克隆了mDDX18的全长c DNA,构建了表达野生型mDDX18及其ATP酶活性位点突变体（mDDX18-K219E）、解旋酶活性位点突变体（mDDX18-S354L）的重组慢病毒。将重组慢病毒转导RAW264.7细胞后用Se V或VSV刺激,Real-time PCR检测IFN-β以及ISG15、ISG56的mRNA表达,ELISA检测细胞上清中IFN-β的含量。结果显示:过表达野生型mDDX18显著抑制Se V和VSV诱导的IFN-β、ISG15和ISG56的表达,而且两种酶活突变体的抑制效果与野生型mDDX18无显著差异。结果表明mDDX18具有抑制IFN-β产生的特性而且不依赖其解旋酶活性和ATP酶活性。3. mDDX18基因敲除小鼠的鉴定与繁育为了进一步证实mDDX18对IFN-β产生的影响,委托生物公司通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了mDDX18基因敲除的F0代小鼠。将F0代DDX18+/-小鼠杂交后,发现获得的子代小鼠为杂合子(DDX18+/-)或野生型(DDX18+/+),没有mDDX18完全敲除的纯合子(DDX18-/-),推测mDDX18基因的完全敲除导致胚胎致死。比较了DDX18+/-小鼠与野生型小鼠的mDDX18表达水平,证实DDX18+/-小鼠的mDDX18表达水平显著降低,但小鼠在体重和形态上并无明显差异,后续使用mDDX18+/-小鼠进行体内研究。4. 敲低小鼠DDX18促进病毒诱导的IFN-β产生分离DDX18+/+与DDX18+/-小鼠腹腔巨噬细胞（mouse peritoneal macrophages,MPM）,分别感染Se V、HSV-1和VSV,分析DDX18+/+与DDX18+/-MPM细胞对病毒诱导的IFN及ISG表达的影响。结果显示:在Se V、HSV-1和VSV感染下,相比于DDX18+/+MPM,DDX18+/-MPM细胞中IFN-β、ISG15和ISG56 mRNA水平显著上调。结果表明,在MPM细胞上,敲低小鼠DDX18上调病毒诱导的IFN-β产生,进一步证实mDDX18负调控IFN-β产生。5. 敲低小鼠DDX18促进HSV-1诱导的抗病毒天然免疫反应将HSV-1经尾静脉注射感染6周龄野生型和DDX18+/-小鼠,同时设置未感染对照。在感染18h后采集血液,通过ELISA检测血清中的IFN-β含量;在感染3d后处死小鼠,采集脑组织和肺脏,通过Real-time PCR检测组织器官中IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA水平,HE染色观察肺脏病理变化,同时通过TCID50检测脑组织中HSV-1的载量。将HSV-1经尾静脉注射感染8周龄野生型和DDX18+/-小鼠,连续12 d观察其存活情况。结果显示:在HSV-1感染条件下,相比野生型小鼠,mDDX18+/-小鼠的脑组织和肺脏中IFN-β、ISG15和ISG56的表达水平明显升高,血清中IFN-β的含量增加,脑组织HSV-1载量降低。与未感染组相比,HSV-1感染导致mDDX18+/-小鼠和野生型小鼠肺组织的肺泡壁明显增宽,并存在淋巴细胞和单核细胞浸润,但HSV-1感染的mDDX18+/-小鼠肺组织出现更多的单核细胞,提示mDDX18+/-小鼠对HSV-1感染产生了更强的抗病毒反应。HSV-1感染条件下,相比野生型小鼠,DDX18+/-小鼠的存活率更高,且两者间存在显著差异。以上结果表明,敲低小鼠DDX18表达可促进HSV-1诱导的IFN-β产生,抑制HSV-1增殖,且DDX18+/-小鼠相比DDX18+/+小鼠对于HSV-1感染具有更强的耐受力。6. 敲低小鼠DDX18促进VSV诱导的抗病毒天然免疫反应进一步以VSV为例,评价了敲低DDX18表达对RNA病毒诱导天然免疫的影响。将VSV-GFP经尾静脉注射感染8周龄野生型和DDX18+/-小鼠,同时设置未感染对照。在感染18h后采集血液,通过ELISA检测血清中的IFN-β含量。在感染1d后处死小鼠,采集肝脏、脾脏和肺脏组织,通过Real-time PCR检测组织中IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA水平,同时通过TCID50检测脾脏和肝脏中VSV-GFP的载量。结果显示:在VSV-GFP感染条件下,相比野生型小鼠,mDDX18+/-小鼠的肝脏、脾脏和肺脏组织中IFN-β、ISG15和ISG56的表达水平明显升高,血清中IFN-β的含量增加,脾脏和肝脏中的病毒含量降低。以上结果表明,敲低小鼠DDX18表达可促进VSV诱导的IFN-β产生,抑制VSV增殖。