脂肪肝是围产期奶牛易患的代谢性疾病之一,会影响奶牛的健康和生产性能,造成巨大的经济损失。围产期奶牛因激素分泌的变化会引起食欲下降,干物质的摄入量减少,机体无法满足分娩后对营养的过度需求,导致能量负平衡,从而动员体内脂肪组织供能,使血液中游离脂肪酸的浓度上升。当肝脏摄取游离脂肪酸的量超过肝脏排出的量,其会以甘油三酯的形式储存在肝脏中,进而引发脂肪肝。目前,肝活检是诊断脂肪肝的金标准,但该方法对奶牛有侵入性的损伤,且检测过程繁琐复杂,不适用于实际生产中的大批量诊断。研究表明,油酸(OA)是游离脂肪酸中的主要成分,与甘油三酯的形成和奶牛生产性能有一定关系,在实际生产中,血液中油酸的含量对确诊奶牛脂肪肝的浸润程度有一定的参考作用。目前,检测OA的方法主要是气相、液相色谱法和液相色谱质谱联用法,但上述方法所需的仪器设备价格昂贵且样品处理过程繁琐,会增加样品的检测时间并影响检测结果的准确性。ELISA是现今广泛使用的一种免疫学检测方法,具有操作简单、特异性强和自动化程度高的特点,适用于大批量样品的快速检测。本实验采用活泼酯法合成OA完全抗原,利用单克隆抗体技术,制备灵敏性高、特异性强的OA抗体,并在此基础上成功建立OA竞争ELISA检测方法。该检测方法的建立对于生产实践具有重要的实用价值和应用前景,有望成为奶牛脂肪肝临床诊断的新手段。1、油酸完全抗原的合成与鉴定OA属于半抗原,只有反应原性,不具有免疫原性,需要与大分子偶联才能作为抗原刺激机体产生抗体。本研究根据OA分子结构,采用活泼酯法将其与二环己基碳二亚胺(DCC)合成亲水的中间产物,再与载体蛋白BSA偶联制备OA-BSA免疫抗原。同时,为避免载体蛋白的交叉反应,采用相同的方法与卵清蛋白(OVA)合成OA-OVA作为包被抗原。合成抗原用BCA试剂盒测定蛋白浓度,并经薄层色谱(TLC)、SDS-PAGE、红外光谱及ELISA方法进行鉴定。结果表明:BCA检测OA-BSA浓度为2.24 mg/mL,OA-OVA浓度为1.83 mg/mL;TLC监测抗原合成过程中有新物质生成;SDS-PAGE分析发现蛋白分子发生改变;红外图谱显示OA-BSA波谱形态与BSA相似且拥有OA的特征峰;小鼠多抗效价达1:6400且有竞争率。这些结果表明,OA与载体蛋白BSA和OVA偶联成功,为下一步OA单克隆抗体的制备奠定基础。2、油酸单克隆抗体的制备以OA-BSA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,并用ELISA法和有限稀释法筛选出一株可稳定分泌针对OA抗体的单克隆细胞株。采用体内诱生法制备腹水,HiTrap Protein G HP纯化柱纯化腹水,并对纯化后的腹水用抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,同时用竞争ELISA对单克隆抗体进行特异性鉴定。结果显示:五免后检测小鼠血清效价为1:12800;筛选出一株单克隆细胞株G-1;成功制备了小鼠腹水,纯化后腹水蛋白浓度为2.27 mg/mL,抗体效价为1:25600,抗体经鉴定为IgG1;竞争ELISA结果显示与烟酸和棕榈酸均无交叉反应。该OA单克隆抗体的制备,为检测OA的CiELISA方法的建立提供了必要材料。3、油酸CiELISA检测方法的建立选用G-1株制备腹水后纯化抗体,用ELISA确定包被原和抗体最佳稀释浓度、最佳封闭液及封闭时间,并用CiELISA制备OA的标准曲线与参数。结果显示:包被原的最佳稀释浓度为1:100;抗体最佳工作浓度为1:200;最佳封闭液为1%明胶,反应时间为30 min;当OA浓度在10～800 ng/mL时,线性关系良好,线性方程为y=0.3504x-0.197(R2=0.9943),IC50 为 95.16 ng/mL,LOD 为 5.16 ng/mL,LOQ 为 20.52 ng/mL。这些结果表明,本文所建立的CiELISA方法具有稳定性好、灵敏度高、特异性强等优点,对奶牛血液中油酸含量的检测及奶牛脂肪肝的临床诊断具有重要的应用价值。