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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,Po RV）是当前导致猪群发生病毒性腹泻的四种主要病原,且常发生混合感染,对我国养猪业危害巨大。这四种腹泻病均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征,只根据临床症状难以区分,需借助实验室方法加以鉴别诊断。本研究建立了PEDV、TGEV、PDCo V及Po RV的四重RT-PCR检测方法,并在此基础上进行PEDV的分离鉴定及毒株的序列分析,具体研究如下:1.针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCo V的N蛋白基因以及Ro RV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的质粒标准品。经过对引物浓度、退火温度、循环数三个参数进行优化后,确定本研究中该四重RT-PCR检测方法的最佳引物浓度为0.375 pmol/μL,最佳退火温度为50.9℃,最佳循环数为30个循环。随后进行敏感性、特异性、重复性试验以对该方法进行验证。敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCo V-N、Po RV-VP7最低检测下限分别为:1.75×10~2Copies/μL、1.5×10~3Copies/μL、1.6×10~2Copies/μL、1.6×10~2Copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检测出本研究中的四种靶病毒,而对猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV、PRV不能检出;重复性试验结果显示,选取10~8、10~6、10~4Copies/μL三个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均可扩增出清晰均匀的条带。将送检的52份临床样品通过所建立的四重RT-PCR方法进行检测,结果显示,PDEV、TGEV、PDCo V、Po RV的阳性率分别为37%（19份）、6%（3份）、10%（5份）、25%（13份）。其中PEDV和Po RV混合感染2份（4%）,PEDV和TGEV混合感染2份（4%）,PEDV和PDCo V混合感染1份（2%）,随机挑选5个检测为阳性的样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。2.将应用上述四重RT-PCR方法检测出的PEDV阳性组织样本挑选出来,用于进行PEDV的分离。将处理好的病料上清接种于Vero细胞,并利用RT-PCR和间接免疫荧光试验（IFA）进行验证,结果成功分离到一株PEDV,命名为QH-202105。将该分离株传代培养至第10代,提取RNA后进行全基因组的扩增并送至公司测序,结合在Gen Bank下载的参考序列,对分离株QH-202105的全基因组进行核苷酸同源性比对和系统发育树的构建。核苷酸同源性比对分析结果显示,本研究分离毒株与美国分离毒株USA/Colorado/2013核苷酸同源性最高,为99.1%;与CHM2013株同源性最低,为96.5%;与变异毒株AJ1102同源性较高,为98.2%;与经典毒株CV777的同源性较低,为96.6%。遗传发育树结果显示,本研究分离株属于G2基因群,与G1基因群中经典毒株CV777属不同分支,与G2基因群中变异株AJ1102亲缘关系很近。同时对QH-202105毒株S蛋白基因进行遗传发育树的构建,并进一步分析QH-202105毒株S蛋白氨基酸序列的变异程度及预测氨基酸突变对其毒株功能的影响。遗传发育树结果显示,本研究中分离株属于G2b亚群,与经典毒株CV777亲缘关系较远,属于变异毒株。S蛋白氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株的S基因全长为4,161bp,编码1,387个氨基酸。进一步同USA lowa107 2013、AJ1102、CHM2013、CV777、DR13、OH851等经典参考毒株进行氨基酸序列变异分析,结果显示分离毒株QH-202105在S蛋白的N端有60多处氨基酸突变,两处氨基酸插入（包括第59-62位QGVN 4个氨基酸插入,第145位氨基酸N的插入）和两处氨基酸缺失（第115-118位氨基酸的缺失,第167-168位氨基酸的缺失）,以及只有分离株在第32位氨基酸处的突变（F→L）、第143位（N→D）、第235位（P→L）、第239位（N→D）。进一步与变异毒株AJ1102进行比较,在S蛋白的其中一个关键抗原中和表位区（aa499-638）发现3处氨基酸的突变,第505处（T→I）,第514处（N→I）,第526处（A→S）。PROVEAN预测结果显示,与变异毒株AJ1102进行S蛋白氨基酸比对发现,本研究中的QH-202105分离株在1,361处氨基酸由G突变为C,此处的突变被判定为“Deleterious”。综上所述,本研究结果以期为猪群病毒性腹泻的高效检测和PEDV变异毒株的流行趋势及防控提供参考。