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肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一种常见的功能性肠病，腹痛、腹胀、大便异常和排便习惯改变为主要特征，包括腹泻型、便秘型、混合型和不定型，以腹泻型较为多见。IBS的全球患病率高，既影响患者的生活质量和工作效率，又消耗大量的公共卫生资源。该病主要的病理生理学基础是肠道动力紊乱和内脏高敏感性，其发病机制尚不完全清楚，可能与肠动力改变、内脏感觉过敏、脑-肠轴功能失调、情志失调、免疫系统紊乱，内分泌功能异常等有关。近年来，随着研究的深入，人们越来越认识到脑-肠轴在IBS的发病中起着重要作用。脑肠肽存在于脑-肠轴中，具有激素和神经递质双重功能，在调节内脏感觉、分泌和运动中起着十分重要的作用。中医药治疗IBS有一定的优势和特色，显示出广阔的应用前景。健脾化湿颗粒(Jianpi Huashi Granule，JPHSG)由炙黄芪、益智仁、炒白术、茯苓、砂仁等10味药组成，采用现代工艺制备而成。具有理气健脾、化湿止泻等功效。本实验采用番泻叶灌胃联合束缚应激的方法建立腹泻型肠易激综合征(Diarrhea-predominant Irritable Bowel Syndrome，D-IBS)大鼠模型，用不同剂量健脾化湿颗粒进行干预，观察其对D-IBS模型大鼠结肠运动功能和内脏敏感性的影响，从中枢神经系统中c-fos、促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-releasing factor，CRF)、促肾上腺皮质激素释放因子受体1(Corticotropin-releasing factor receptor1，CRF-R1)及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的变化来研究其作用机制，为健脾化湿颗粒治疗D-IBS提供理论依据。第一部分健脾化湿颗粒治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠的药效学研究目的：观察JPHSG对D-IBS模型大鼠体重、结肠运动功能和内脏敏感性的影响，评价其治疗作用。方法：1动物分组及造模♂SD大鼠72只，随机分为正常对照组(NC)、模型对照组(M)、健脾化湿颗粒低剂量组(JPHSG-L)、健脾化湿颗粒中剂量组(JPHSG-M)、健脾化湿颗粒高剂量组(JPHSG-H)和阳性对照组(PC)。除NC组外，其余各组采用番泻叶水浸液灌胃联合束缚应激的方法建立D-IBS大鼠模型。2各组用药及处理成模后，各治疗组分别给予相应的药物治疗，NC组和M组给予等体积的生理盐水，给药14d。3药效学观察分别在建模前、建模7d、建模14d、药物干预7d和药物干预14d，称量各组大鼠的体重；采用四导生理记录仪记录大鼠结肠运动曲线，计算结肠运动指数及运动指数变化率；采用直肠扩张腹壁撤退反射(AWR)评分为3分时的注水量评价大鼠的内脏敏感性。4肠组织病理检查大鼠处死后，取远端结肠做常规病理切片HE染色，在显微镜下观察，排除肠粘膜炎性病变。结果：1JPHSG对D-IBS模型大鼠体重的影响建模前，各组间无显著差异(P>0.05)；建模后，各建模组大鼠体重增长缓慢，与NC组大鼠相比有显著差异(P<0.01)；药物干预后，与M组大鼠相比，JPHSG-H组大鼠体重显著增加(P<0.05)，其他治疗组与M组大鼠相比虽有所增加，但无显著差异(P>0.05)。2JPHSG对D-IBS模型大鼠结肠运动功能的影响建模前，各组间无显著差异(P>0.05)；建模后，各建模组大鼠运动指数和运动指数变化率均增加，与NC组大鼠相比有显著差异(P<0.01)；药物干预后，与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠运动指数和运动指数变化率均显著降低(P<0.01)，与PC组大鼠相比，JPHSG高剂量组大鼠显著降低(P<0.05)。3JPHSG对D-IBS模型大鼠内脏敏感性的影响建模前，各组间无显著差异(P>0.05)；建模后，各建模组大鼠AWR评分为3时的注水量均降低，与NC组大鼠相比有显著差异(P<0.01)；药物干预后，与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠AWR评分为3时的注水量均显著增加(P<0.01)，与PC组大鼠相比，JPHSG高剂量组大鼠显著增加(P<0.05)。4肠组织病理检查病理学检查各组大鼠均无水肿、溃疡、充血、炎症细胞浸润等病理改变，与NC组大鼠相比，其他各组未见明显差异。结论：JPHSG对D-IBS模型大鼠有很好的治疗作用，可以显著的改善D-IBS模型大鼠的结肠运动功能，降低肠道敏感性。第二部分健脾化湿颗粒治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠的中枢机制研究目的：观察JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的影响，探讨其作用机制。方法：1标本的采集与处理药物干预14d后，麻醉处死大鼠，迅速取出腰膨大段脊髓、前额叶皮质、海马和下丘脑，一部分置于4%的多聚甲醛中固定，用于免疫组化实验；一部分置于-80℃冻存，用于ELISA和PCR实验。2采用免疫组化法检测各组大鼠中枢c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的表达水平，计算其平均光密度值(mean density)，进行半定量分析。3采用ELISA法检测各组大鼠中枢c-fos和5-HT的含量4采用PCR法检测各组大鼠中枢CRF和CRF-R1mRNA的表达水平，计算其相对光密度值(ROD)，进行半定量分析。结果：1JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT表达水平的影响光镜下观察，大鼠中枢c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的阳性表达呈棕黄色或深棕色颗粒，NC组大鼠中枢上述指标表达微弱甚至不表达，而M组大鼠中枢可见较多的阳性表达。1.1JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢c-fos表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠脊髓背角、前额叶皮质、海马和下丘脑中c-fos的阳性表达均显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.01)；JPHSG-L组大鼠前额叶皮质和海马中显著降低(P<0.05，P<0.01)，而脊髓背角和下丘脑中c-fos表达无显著差异(P>0.05)；与PC组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)。1.2JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢CRF表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠脑中前额叶皮质、海马和下丘脑中CRF的阳性表达均显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均均显著降低(P<0.01)，JPHSG-L组大鼠海马中显著降低(P<0.01)，前额叶皮质和下丘脑中CRF表达无显著差异(P>0.05)；与PC组大鼠相比：JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)。1.3JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢CRF-R1表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠脑中前额叶皮质、海马和下丘脑中CRF-R1的阳性表达均显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.01)，JPHSG-L组CRF-R1表达无显著差异(P>0.05)；与PC组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)。1.4JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢5-HT表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠脑中前额叶皮质、海马和下丘脑中5-HT的阳性表达均显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠各部位的表达均显著降低(P<0.01)，JPHSG-L组5-HT表达无显著差异(P>0.05)；与PC组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠的表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)。2JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢c-fos、5-HT含量的影响2.1JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢c-fos含量的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠大鼠脊髓和海马中c-fos的含量显著增加(P＜0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠脊髓和海马中的含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)；与PC组大鼠相比，JPHSG-H组大鼠脊髓和海马中的含量显著降低(P<0.05)；JPHSG-M组c-fos含量无显著差异(P>0.05)。2.2JPHSG对D-IBS模型大鼠脑中5-HT含量的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠海马中的5-HT含量显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠海马中的含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)；与PC组大鼠相比，JPHSG-H海马中的含量显著降低(P<0.05)，JPHSG-L组5-HT含量无显著差异(P>0.05)。3JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢CRF和CRF-R1mRNA表达水平的影响3.1JPHSG对D-IBS模型大鼠脑中CRF mRNA表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠前额叶皮质和海马中CRF mRNA的表达显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，各治疗组前额叶皮质和海马中的表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)；与PC组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠前额叶皮质和海马中的表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，JPHSG-L组CRF mRNA表达无显著差异(P>0.05)。3.2JPHSG对D-IBS模型大鼠中枢CRF-R1mRNA表达水平的影响与NC组大鼠相比，M组大鼠前额叶皮质和海马中CRF-R1mRNA的表达显著增加(P<0.01)；与M组大鼠相比，各治疗组前额叶皮质和海马中的表达显著降低(P<0.05，P<0.01)；与PC组大鼠相比，JPHSG中、高剂量组大鼠前额叶皮质和海马中的表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，JPHSG-L组CRF-R1mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论：JPHSG治疗D-IBS模型大鼠的机制可能与降低其中枢c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的表达有关。