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共生信号的转导机制一直是共生固氮研究领域的热点。目前,在豆科植物中,通过遗传学手段分离、鉴定出了一系列参与共生信号调控的基因,如NFR1、NFR5、SymRK、CCaMK等。其中,百脉根共生受体激酶SymRK是共生信号转导途径中的关键基因,该基因的突变会导致豆科植物早期共生信号的中断。因此,找到SymRK在共生途径中的上下游合作伙伴对于研究其功能并完善共生信号调控网络有重要意义。本实验室前期研究中利用酵母双杂验证了百脉根中BAK1/SERK3与SymRK有相互作用。在此基础之上,本研究以百脉根SERK基因家族中LjSERK2和LjBAK1/SERK3为研究对象,初步探索了豆科植物共生信号转导途径中SERKs家族与SymRK之间的关系。主要研究结果如下:1.对百脉根SERKs家族氨基酸的三维结构进行分子模拟和比对分析,发现其中两个基因分别与拟南芥中AtBAK1/SERK3、AtSERK2同源性非常高,其结构相似度高达90%以上。因此将其命名为LjBAK1/SERK3、LjSERK2。2.利用放射性自显影技术验证了 LjSERK2、LjBAK1/SERK3的蛋白激酶活性。通过与SymRK之间的相互磷酸化实验发现LjBAK1/SERK3可作为SymRK的磷酸化底物,而LjSERK2与SymRK之间无相互磷酸化现象。3.利用体外pull-down技术证明了 LjSERK2与SymRK二者激酶域无相互作用,而LjBAK1/SERK3自磷酸化活性缺失型可与SymRK激酶域相互作用。结合体外磷酸化的结果表明:LjBAK1/SERK3可能参与SymRK在共生途径中的信号转导。4.通过对LjBAK1/SERK3LORE1插入突变体的研究发现:在接种根瘤菌5天后,bak1纯合突变体的侵染线总数和根瘤原基数与野生型相比都有明显增加。该结果表明LjBAK1/SERK3可能参与负调控共生信号转导途径。CRISPR/Cas9 系统是最新一代序列特异核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)。该系统利用RNA-DNA互补配对的方式特异性识别基因组靶位点。CRISPR/Cas9系统构建简单并且编辑效率高,因此在植物体基因组编辑中得到广泛运用。本文第二章中将CRISPR/Cas9系统与豆科植物毛根转化相结合,探索了CRISPR/Cas9在豆科植物中实现基因编辑的可行性。具体研究成果如下:1.参考新一代CRISPR/Cas9系统,将其中的sgRNA表达单元改造成多个tRNA-sgRNA串联的PTG(polycistronic tRNA-gRNA,PTG)模式,构建了适用于豆科植物百脉根的CRISPR/Cas9系统。2.利用毛根转化技术将CRISPR/Cas9系统应用于豆科植物百脉根的基因组编辑中。选取共生信号通路中的结瘤因子受体基因NFR1为靶基因进行敲除。3.分析转基因毛根的共生表型发现:在转基因阳性毛根中分离得到NFR1基因敲除的突变型,突变效率约为37.5%。4.利用DNAMAN分析突变体基因序列发现:CRISPR/Cas9系统对百脉根NFR1的编辑多为插入或者缺失突变。其中,LjNFR1基因中靶位点1的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0。暂未能检测到大片段的敲除或者倒位等突变类型。