当前各类淋巴瘤中以B细胞淋巴瘤的发病率最高,其中滤泡淋巴瘤及小淋巴细胞淋巴瘤对DC免疫治疗较为敏感,国外已经开展了多项临床试验,初步观察到一定的疗效,但没有获得最终的成功,离临床广泛应用还有较大的差距,主要是目前使用的DC免疫治疗策略仍难以克服淋巴瘤复发的问题。我们认为这与患者体内存在的免疫抑制环境有关,也与目前采用的DC疫苗接种模式不当有关,此外复发、难治淋巴瘤患者体内巨大的肿瘤负荷也成为DC免疫治疗的主要障碍。增强DC免疫治疗疗效的一个策略是清除肿瘤患者体内异常增多的免疫抑制细胞。近年来大量研究显示多种类型的肿瘤(包括淋巴瘤)患者体内的髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)异常增多,大量累积的MDSC是肿瘤患者体内主要的免疫抑制细胞,MDSC能够通过分泌多种抑制因子,抑制T细胞及NK细胞的功能,在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。应用化疗药物清除免疫抑制细胞可以成为DC疫苗治疗的重要协同策略。一项研究显示低剂量吉西他滨可以选择性清除间皮瘤荷瘤小鼠体内的MDSC,而不杀伤T细胞和B细胞。因此通过吉西他滨化疗一方面可以杀伤肿瘤细胞降低肿瘤负荷,另一方面可以清除体内MDSC而有效解除免疫抑制。增强DC免疫治疗疗效的另一个策略是改变目前DC疫苗的接种模式,以往大都采用肿瘤抗原体外冲击的DC作为疫苗,通过皮下注射等方式进行接种,这种方法并不符合体内DC抗肿瘤的生理过程,存在诸多不足。改用未经体外抗原冲击的半成熟(semi-mature)DC瘤内注射的方法进行免疫接种,能够更好地保持DC的活性和功能,在瘤体内注射后可以更加直接、充分地接触、摄取肿瘤细胞死亡后释放的抗原及DAMP(damage associated molecular pattern),分化为成熟的DC。这一方法更加符合体内DC抗肿瘤的生理过程,并且在数量和质量上能够更加保证对抗肿瘤免疫功能的充分激发。目前尚不明确MDSC是否能够促进小鼠B细胞淋巴瘤的生长、淋巴瘤荷瘤小鼠体内的MDSC是否增多、增多的MDSC对吉西他滨化疗是否敏感,以及在吉西他滨化疗后序贯进行瘤内注射半成熟DC治疗淋巴瘤,二者是否能够发挥抗肿瘤协同效应。目的:1建立小鼠MDSC体外培养新体系:模拟MDSC在体内发育生成的微环境,扩增出大量高纯度的MDSC,研究其对小鼠B细胞淋巴瘤体内生长的影响;2进一步检测淋巴瘤荷瘤小鼠体内MDSC的数量及吉西他滨对小鼠MDSC的体内外清除作用,观察经过吉西他滨处理的淋巴瘤细胞对半成熟DC分化成熟的影响;3最后应用吉西他滨化疗后序贯进行瘤内注射半成熟DC的方案治疗小鼠B细胞淋巴瘤,检测小鼠体内抗肿瘤免疫功能并观察二者是否能够发挥抗肿瘤协同效应,并分析哪种免疫效应细胞起主要的作用。方法:1.以丝裂霉素C灭活的脾脏内皮型基质细胞107B作为饲养层细胞,加入小鼠骨髓细胞及高剂量mGM-CSF,以无血清培养基培养获MDSC;以流式细胞仪检测细胞免疫表型;抗Gr-1抗体标记后免疫磁珠进一步分选纯化MDSC,应用甲基纤维素半固体培养基进行集落形成细胞检测,以及尾静脉回输全身照射(8Gy)的小鼠检测脾集落形成单位(CFU-S);应用荧光探针DCFDA检测ROS的产生,异去硝基苯丙酮测尿素法测定精氨酸酶;CCK8法检测MDSC体外对Con-A刺激的T细胞增殖的影响,流式细胞仪检测MDSC对OT-1小鼠来源的OVA多肽特异性CD8+T细胞(CFSE标记)增殖的影响;流式检测MDSC回输Foxp3-IRES-GFP小鼠后外周血Treg细胞的比例变化;应用急性GVHD模型观察MDSC回输后小鼠的排异症状以及小鼠的生存率;MDSC与A20淋巴瘤细胞共同皮下接种后监测淋巴瘤体内生长的情况。2.皮下接种2×105的A20细胞建立小鼠淋巴瘤模型,第30天小鼠皮下形成直径>2.0cm的淋巴瘤后,取小鼠脾脏,抗Gr-1-PC5、抗CD11b-PE抗体标记后流式细胞仪检测荷瘤小鼠脾脏内MDSC的比例;免疫磁珠分选Gr-1+的荷瘤小鼠脾脏MDSC,流式检测细胞免疫表型;分选获得的MDSC加入吉西他滨(10μg/ml)培养24h、48h后,以AnnexinV-FITC/PI染色后流式检测凋亡;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120mg/kg吉西他滨,48h后流式检测小鼠脾脏中MDSC的比例及淋巴瘤细胞发生凋亡的比例;小鼠骨髓细胞加入mGM-CSF培养获半成熟DC,加入经吉西他滨(10 μg/ml)预处理4h的A20细胞,混匀共同培养48h后标记抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗体,流式分析DC的成熟分化情况;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120mg/kg吉西他滨,48h后序贯进行瘤内注射5×106的CFSE标记DC,48h后取小鼠外周血、脾脏及DC注射部位的肿瘤组织制备细胞悬液,标记抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗体,流式分析DC的成熟分化情况。3.取荷瘤30天的小鼠随机分组,腹腔注射吉西他滨(120mg/kg)或生理盐水,第32天瘤内注射DC或生理盐水,5组分别为:a.腹腔注射生理盐水+瘤内注射生理盐水(NS组)、b.腹腔注射生理盐水+瘤内注射DC5×105/只(DC组);c.腹腔注射吉西他滨+瘤内注射生理盐水(GEM组);d.腹腔注射吉西他滨+瘤内注射DC5×105/只(GEM+DC组);e.腹腔注射吉西他滨+瘤内注射DC5×105/只+MDSC5×106/只(GEM+DC+MDSC组),观察肿瘤的生长情况,每3天测量小鼠移植瘤的长径及短径,观察各组小鼠的生存时间;DC瘤内注射后第7天,取各组3只小鼠脾脏制备细胞悬液,ELISA检测培养上清中IFN-γ的水平;小鼠脾脏细胞加丝裂霉素C灭活的A20细胞及50IU/mL的mIL-2体外培养5天后,LDH释放法检测对A20细胞的杀伤;取各组小鼠脾脏及肿瘤组织制备单细胞悬液,分别加入抗CD4-PE、抗CD8-FITC及抗DX5-PE抗体标记后流式检测T细胞及NK细胞的比率;取各组小鼠肿瘤组织经4%多聚甲醛溶液固定后切片,加入抗DX5-PE抗体及抗NKG2D-FITC抗体孵育后,DAPI液核染色后激光扫描共聚焦显微镜检测瘤内NK细胞的数量;在淋巴瘤接种后的第24、26、28、30、32及35天给小鼠腹腔注射300mg的抗asialo-GM1抗体清除体内NK细胞,或给小鼠腹腔注射1OOmg的抗CD4抗体(GK1.5)及抗CD8抗体(T1B105)清除体内T细胞,观察体内清除这些免疫细胞后对吉西他滨与DC联合治疗淋巴瘤疗效的影响。结果:1.应用小鼠脾脏内皮型基质细胞作为饲养细胞,模拟MDSC体内发育的微环境,从单只小鼠的骨髓细胞体外培养9天可以获得4× 1 08细胞,其中CD 11 b+Gr-1+的MDSC的比例达90%,与荷瘤小鼠体内MDSC的免疫表型相似。体外CFC检测表明培养第7天生成大量CFU-GM、少量CFU-G及部分散在的成熟的单核细胞,而不生成其它集落:1×103 MDSC回输辐照小鼠后可以生成平均12-15个晚期脾结节。生成的MDSC具有极强的免疫抑制活性,能够抑制Con-A刺激的T细胞增殖以及OVA多肽刺激的抗原特异性CD8+T细胞增殖;MDSC回输小鼠后外周血中Treg细胞的比例增高3倍左右,能够抑制急性GVHD,减轻GVHD症状,小鼠的死亡率由100%降至40%;与A20淋巴瘤细胞共同接种后淋巴瘤在小鼠的体内的生长速度明显加快。2.在接种A20淋巴瘤细胞30天后的小鼠脾脏中MDSC的比例显著增高达30%左右,MDSC的绝对数量超过正常小鼠的10倍。体外MDSC经10ug/ml吉西他滨处理48h后83.2%的细胞发生了凋亡,应用吉西他滨化疗后荷淋巴瘤小鼠脾脏中MDSC的比例降为6.9%;吉西他滨化疗也导致体内A20淋巴瘤细胞发生凋亡。经吉西他滨预处理4h的A20细胞与DC共同培养48h后,DC表达CD86的比例由11.3%增加至49.6%;荷淋巴瘤小鼠给予吉西他滨化疗后瘤内注射半成熟DC,48h后可以检测到回输的DC中有82.8%转变为CD86+表型,而未接受化疗组仅为26.2%。3.荷淋巴瘤小鼠接受吉西他滨注射后序贯进行瘤内注射半成熟DC的治疗后,小鼠脾细胞分泌的IFN-γ较对照组增高近10倍,杀伤A20肿瘤细胞的CTL活性显著增高,肿瘤逐渐缩小并最终消失,90%的小鼠获得长期生存,而对照组小鼠均最终死亡。接受联合治疗的淋巴瘤荷瘤小鼠,流式检测脾脏内及瘤内CD4+及CD8+T细胞的比例与其他组无显著差异,而瘤内NK细胞比例由2.2%增高至6.9%,应用激光扫描共聚焦荧光显微镜检测进一步证实,瘤内浸润的NK细胞较对照组显著增加;单抗体内清除实验表明,清除CD8+T细胞、NK细胞后联合治疗组的抗肿瘤效应均有所减弱,而清除NK细胞组的作用最为明显,肿瘤的生长速度与对照组接近。结论:1.成功建立了体外大规模扩增高纯度小鼠MDSC的培养体系,体外培养生成的MDSC具有强烈的免疫抑制活性,与A20淋巴瘤细胞共同接种小鼠能够显著促进淋巴瘤的生长。2.接种A20淋巴瘤细胞的小鼠在后期体内也出现MDSC累积增多的现象,吉西他滨可以诱导MDSC发生凋亡,快速去除荷淋巴瘤小鼠体内的MDSC,也可以诱导A20淋巴瘤细胞发生凋亡,并促进瘤内DC的分化成熟。3.吉西他滨化疗后序贯进行瘤内注射治疗半成熟DC可以产生协同抗肿瘤效应,可以激活体内免疫细胞,有效清除巨大淋巴瘤并阻止复发,显著提高小鼠存活率。CD8+T细胞及NK细胞均参与了抗肿瘤免疫应答,而NK细胞是最主要免疫效应细胞。