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研究背景:重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种获得性自身免疫性疾病,其致病性抗体与神经肌肉接头处(neuromuscularjunction,NMJ)突触后肌肉终板膜上的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)或其他功能相关分子结合,进而诱导骨骼肌无力,这是该疾病唯一的临床表现[1,2]。肌无力症状可局限或者泛发,近端受累多于远端,且随着肌肉的重复使用(疲劳)而增加,在一天内不同时间有所波动。胸腺的异常(胸腺增生和胸腺瘤形成)对抗AChR抗体阳性MG的发病起到重要的诱导作用[3,4],并且遗传易感性也可能会影响个体是否会患病[5]。此外,该病临床症状及其相关特征的多样性允许我们根据疾病分布(眼部或全身性),发病年龄,胸腺异常和自身抗体将MG分为不同亚型。MG及其各个亚型是影响神经肌肉接头处的主要疾病,每年发病率为(8.0～10.0)/100万,患病率为(150.0～250.0)/100万[6]。目前,溴吡斯的明是首选的对症治疗方法,对于对症治疗反应不佳的患者,皮质类固醇,硫唑嘌呤和胸腺切除术是一线治疗方法。这些治疗手段仅能缓解临床症状但不能治愈MG,且免疫抑制多为非特异性的,由此也带来了感染、骨髓抑制等副作用,因此积极寻找靶点特异和副作用小的治疗方法是当今国际MG研究领域的热点。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)在自身免疫性疾病中的免疫调节作用愈加受到重视。我们课题组前期研究发现大鼠的外周血、脾脏和淋巴结中存在CXCR5+NK细胞,其数量与滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells,Tfh)的数量呈正相关;而脾脏来源的总NK细胞可缓解实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)模型大鼠的临床症状[7]。本课题通过临床实验研究MG患者外周血中NK细胞和CXCR5-/+NK细胞的比例、表面共刺激分子表达及细胞因子分泌,探究NK细胞、CXCR5+NK细胞对MG的Tfh细胞、滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cells,Tfr)和B细胞的作用及调节机制。研究结果有望揭示NK细胞及其亚群在MG病情转归中的作用及可能的免疫调控机制,为MG和其他自身免疫性疾病的治疗提供新的免疫细胞干预靶点。目的:探索NK细胞及其亚群在MG疾病中的作用,明确CXCR5+NK细胞对Tfh、Tfr和B细胞的作用及调节机制,为MG治疗提供新的免疫细胞干预靶点。研究对象及方法:1.研究对象:按照一定的纳入标准、排除标准收集山东大学附属千佛山医院神经内二科2018年7月至2020年1月收治的门诊及住院MG患者临床资料,同时纳入查体中心与MG组性别、年龄匹配的志愿者为对照组,采集MG患者及志愿者人口学信息、临床资料及血标本,分离血清、外周血单个核细胞(PBMCs)。本研究由山东大学附属千佛山医院伦理委员会批准,入组的患者均被告知本研究。2.实验方法:运用流式细胞术检测对照组志愿者、加重期和缓解期MG患者外周血中CD4+CXCR5+Tfh、CD4+CXCR5+ICOS+Tfh、CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr、CD3-CD19-CD56+NK、CD3-CD19-CD56dimNK、CD3-CD19-CD56brightNK、CD3-CD19-CD5 6+CXCR5+NK 及 CD3-CD19-CD56+CXCR5-NK 细胞的比例;检测CD3-CD19-CD56+NK细胞表面共刺激分子PD-1、ICOS表达及NK1(CD3-CD19-CD56+IFN-γ+)、NK3(CD3-CD19-CD56+IL-10+)、NK17(CD3-CD19-CD56+IL-17+)细胞的比例;检测CXCR5-NK及CXCR5+NK细胞表面共刺激分子PD-1、ICOS及胞内细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17的表达;比较各组间 Tfh、ICOS+Tfh、Tfr 细胞比例的差异,NK、CD56dimNK、CD56brightNK、CXCR5-NK、CXCR5+NK细胞比例、表型及分泌细胞因子的差异,并通过Spearman相关检验评估了 CXCR5+NK细胞比例、Tfh细胞比例、ICOS+Tfh细胞比例、Tfh/Tfr比值、ICOS+Tfh/Tfr比值以及B细胞比例之间的相关性。结果:1.本研究共纳入研究对象37人,在MG加重组、MG缓解组和对照组中,男性构成比分别为6人(40%)、6人(60%)和男性7人(58.3%),性别构成无统计学差异(P=0.539);三组研究对象年龄无统计学差异(55.40±3.35,55.50±4.47,52.17±3.44,P=0.774)。MG加重组和MG缓解组QMG评分具有统计学意义(13.53±1.81,4.20±0.61,P<0.01)。2.MG加重组及缓解组外周血Tfh细胞比例较对照组无明显差异(P>0.05,P>0.05);缓解组ICOS+Tfh细胞比例较加重组及对照组有降低趋势,但无统计学意义(P=0.350,P=0.124);加重组Tfr细胞比例较对照组有降低的趋势,缓解组Tfr细胞比例较加重组增高,结果具有统计学差异(P=0.322,P<0.05);加重组Tfh/Tfr比值较对照组增高,缓解组Tfh/Tfr比值较加重组明显下降(P<0.05,P<0.01);加重组ICOS+Tfh/Tfr比值较对照组有增高趋势,而缓解组ICOS+Tfh/Tfr比值较加重组下降,结果具有统计学差异(P=0.278,P<0.05)。3.MG患者外周血总NK细胞、CD56dim/brightNK细胞、CXCR5+NK细胞比例随病情变化而变化。加重组CD3-CD19-CD56+总NK细胞比例较对照组明显下降,而缓解组总NK细胞比例较加重组明显增高(P<0.01,P<0.01);加重组CXCR5+NK细胞比例较对照组显著增高,缓解组CXCR5+NK细胞比例较加重组有明显下降趋势(P<0.0001,P=0.077);缓解组CD56brigtNK细胞比例较对照组下降,较加重组有明显下降趋势(P<0.05,P=0.064),而CD56dimNK细胞比例较对照组增高,较加重组有明显增高趋势(P<0.05,P=0.061)。4.MG患者外周血CXCR5+NK细胞比例与ICOS+Tfh细胞比例、ICOS+Tfh/Tfr比值、B 细胞比例呈正相关(R=0.39,P=0.03;R=0.37,P=0.04;R=0.52,P=0.04);MG患者及对照组志愿者外周血ICOS+Tfh细胞比例和ICOS+Tfh/Tfr比值与B细胞比例呈正相关(R=0.37,P=0.04;R=0.39,P=0.009)。5.MG患者外周血CXCR5+NK细胞与CXCR5-NK细胞表面分子及细胞因子表达存在显著差异。与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞表面共刺激分子ICOS和PD-1的表达明显增高(P<0.0001,P<0.0001);CD56分子的表达在两群细胞中无明显差异(P>0.05,P>0.05);与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞分泌IFN-γ的水平显著降低(P<0.001),IL-17和IL-10的分泌水平则无明显差异(P>0.05,P>0.05)。6.MG缓解组外周血ICOS+NK细胞比例较加重组及对照组有较强的下降趋势(P=0.086,P=0.166),但无统计学差异;PD-1+NK细胞比例在加重组较对照组显著增高,在缓解组较对照组增高,但在加重组的增高程度更为显著(P<0.001,P<0.05)。7.MG加重组外周血NK1细胞比例较对照组显著降低,缓解组NK1细胞比例则较加重组明显增高,恢复至正常水平(P<0.001,P<0.01);加重组NK3细胞比例较对照组有明显下降趋势,而缓解组NK3细胞比例较加重组增高,恢复正常水平(P=0.129,P<0.05);外周血NK17细胞比例在三组间无明显差异(P>0.05,P>0.05)。结论:NK细胞及其亚群在重症肌无力疾病转归过程中发挥了重要作用。NK细胞,尤其是CD56dimNK细胞亚群和分泌IFN-γ的NK1细胞亚群对MG具有保护作用,这种保护作用可能是通过NK细胞针对其他免疫细胞的杀伤效应介导的。CXCR5+NK细胞对MG病情加重起了促进作用。CXCR5+NK细胞可能是通过在生发中心内高表达共刺激分子ICOS以及降低IFN-γ的分泌调节MG病程中Tfh细胞、ICOS+Tfh细胞、Tfr细胞以及B细胞的变化,调节体液免疫反应,进而参与对MG的免疫调控。