链格孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)是自然界三大致病植物真菌之一。来自外来恶性杂草紫茎泽兰(Ageratina adenophora)致病型链格孢菌能够产生一种毒素——细交链格孢菌酮酸(TeA),该毒素在较低的浓度下能够迅速杀死紫茎泽兰以及其它多数单双子叶杂草,具有开发成生物除草剂的潜力。TeA杀草的主要机理是与光系统Ⅱ的D1蛋白结合,抑制光系统Ⅱ受体侧QA到QB之间光合电子的传递,引起过能量化,导致在叶绿体中活性氧爆发,引起叶绿体结构破坏,大量活性氧扩散到整个细胞中,进一步引起膜脂过氧化、细胞膜破裂、细胞器解体、细胞核浓缩和DNA断裂,导致细胞死亡和组织坏死,最终杀死杂草。本研究利用通过限制性内切酶介导整合法(REMI)获得的弱毒突变体001和野生型为研究材料来阐明TeA在病原体入侵寄主叶片阶段的作用机理。利用野生型和缺毒突变体(菌丝体)为材料接种寄主紫茎泽兰叶片,突变体接种时结合加入TeA.研究结果表明TeA是链格孢菌病原体侵染寄主引起病害的主要毒理因子。来自Imaging-PAM结果显示:野生型菌丝接种寄主紫茎泽兰叶片1 8h后,植物的PSII活性降低,36小时,病害开始出现;而对应时间下,突变体菌丝处理紫茎泽兰叶片并没有引起明显的PSII活性降低和病害出现,但在突变体菌丝中加入一定浓度的TeA后可以得到与野生型相似的结果,突变体的致病能力得到一定程度的恢复。同时,添加毒素也能恢复部分突变体菌丝扩展的能力。通过监测孢子萌发和生长、附着胞形成与否、菌丝在细胞和叶片中生长和扩散情况、病斑产生情况,发现毒素在病原体侵入叶片组织和菌丝扩张、病害的发展过程中都发挥作用,是病原体成功入侵和病斑形成的重要因子。在野生型孢子或者菌丝体引起紫茎泽兰叶片病害过程中我们检测到细胞死亡现象,这意味着活性氧(ROS)也许参入到该过程。为了进一步阐明TeA在链格孢菌病原体入侵寄主过程的作用机制,我们进行了一系列实验来探究在链格孢菌致病过程中TeA与活性氧(ROS)产生、细胞死亡和病害发展之间的关系。DAB和NBT染色结果表明野生型病原体处理紫茎泽兰叶片5小时后ROS明显产生;但是,突变体病原体处理并没有引起ROS的产生,在TeA存在的情况下,突变体处理也能够引起活性氧的显著增加。活性氧清除剂CAT和DPI预处理能够明显降低野生型病原体引起的叶片PSII活性伤害、病害发展和病斑形成。活性氧清除剂对病原体-菌丝在叶片组织中扩散有显著影响,CAT和DPI的预处理明显降低了菌丝的发展速度,但是对病原体最初的侵入过程没有影响。这表明毒素TeA在链格孢菌病原体引起寄主病害过程中的作用方式是通过诱导活性氧产生、引起细胞死亡、帮助病原体在组织中快速扩算,最终引起组织的坏死,从而为病原体的进一步繁殖和生长提供营养物质。为了进一步证明这种作用机制,我们利用另外2种能够引起植物叶片坏死的化合物AAL-toxin(链格孢菌产生的另外一种毒素)和除草剂苯达松代替TeA进行处理。我们发现,AAL-toxin和苯达松像TeA一样,能够帮助链格孢菌突变体回复部分致病能力,能够明显促进突变体菌丝在叶片中的扩散和病斑的形成。这表明,毒素TeA引起细胞死亡是链格孢菌病原体在叶片组织中成功扩散和病害发展的重要条件。链格孢菌在引起植物病害过程中,活性氧产生和细胞死亡的出现意味着激活了某些病理信号途径。以拟南芥为材料,利用半定量RT-PCR分析了链格孢菌野生型和突变体孢子处理后单线态氧和过氧化氢标记基因aaa+-ATPase和ferritin,和一些病理相关基因pr1,sib1,wrky33,wrky4 基因的表达情况。结果表明,野生型孢子处理拟南芥叶片12小时后,各基因表达水平迅速增加,但突变体孢子处理拟南芥相关基因表达量明显低于野生型处理植株。本研究确立了 TeA毒素在链格孢菌病原体侵染寄主植物过程中的关键毒力因子地位,基本明确了其在入侵寄主叶片和病害发展阶段的作用机制,初步揭示了单线态氧和过氧化氢介导的信号途径可能参入了链格孢菌病原体与拟南芥相互作用过程。