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目的:以结肠癌细胞系HCT116为主要研究对象,探究p53基因是否调控癌干细胞表面标志物CD133的表达及作用机制,并研究DNA损伤响应调控蛋白DNA-PKcs的抑制剂NU7026对结肠癌干细胞的放射增敏作用。方法:蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹杂交法(western blot),检测细胞系中相关蛋白的表达;以癌干细胞表面标志物CD133/CD44作为标记,通过流式细胞术分别检测p53野生型和p53突变型结肠癌细胞系中的癌干细胞亚群分布比例;实时定量RT-PCR(quantitative Real time-PCR)方法测定CD133和p53基因m RNA转录表达水平;通过瞬时基因转染的方法将sh RNA表达质粒或p53基因真核表达质粒载体转染入细胞,构建干扰p53基因表达或者过表达p53基因的细胞模型;构建CD133启动子启动荧光素酶标记基因表达的重组质粒;用化学发光仪检测CD133启动子转录双荧光素酶活性。将含有高癌干细胞亚群比例的HCT116细胞系分成四个组:实验对照组,20μmol/L NU7026作用组,2 Gyγ射线照射组,20μmol/L NU7026联合2 Gy辐射组,γ射线照射前2小时加入NU7026后,通过细胞克隆形成实验和MTT检测HCT116细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期,细胞凋亡,癌干细胞亚群变化,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察各组细胞并统计其gH2AX foci点均数等,分析评价NU7026对高癌干细胞亚基比例的结肠癌HCT116细胞系的放射增敏作用及其DNA双链断裂损伤修复反应的影响。结果:首先通过western blot验证了p53野生型结肠癌细胞HCT116p53+/+和p53突变型结肠癌细胞HCT116p53-/-的p53表达状态,确保了实验细胞模型的可靠性;CD133阳性亚群比例,在p53野生型细胞中高达84.84±0.05%,而在p53突变型细胞中只有4.13±0.02%;CD133基因m RNA转录表达检测结果显示,野生型细胞和突变型细胞的相对表达水平分别为0.16±0.041和0.0081±0.0039(t=6.29,P<0.01),表明不同p53状态的两HCT116细胞系之间癌干细胞表面标志物CD133的表达水平存在显著差异;在HCT116p53+/+中,通过si RNA干扰技术抑制p53蛋白表达后,CD133转录表达水平也随着下降,CD133阳性亚群比例也下降(从85.78±1.17%降至4.70±0.17%,t=119.79,P<0.0001)。抑制p53表达,CD133启动子的转录激活活性也显著下降;在HCT116p53-/-细胞系中过表达外源的p53蛋白,CD133转录表达水平也随之增加,为对照组的1.58倍。CD133启动子转录激活活性明显增加,且具有统计学意义。CD133亚群比例略增(从4.52±0.35%升至5.83±0.30%,t=4.92,P<0.01);在293T细胞系中,分别转染p53过表质粒和p53干扰si RNA表达质粒,检测发现CD133启动子活性随p53蛋白的表达量增加而增加,或随p53蛋白表达抑制而减少。在p53野生型结肠癌HCT116细胞试验中,20μmol/L NU7026+2 Gy组与单独2 Gyγ射线辐照组比较,显示出NU7026的放射增敏作用:细胞增殖慢,细胞克隆形成率明显下降(t=7.21,P<0.01),存活率降低更加显著(t=7.22,P<0.01);照射后24小时G2/M期不可逆阻滞明显增加(t=7.67,P<0.01),在48小时,细胞早期凋亡率明显增加(t=8.24,P<0.05);作为DNA双链断裂分子标记的细胞gH2AX foci的均数点明显增多;更为重要的是,单独照射后48 h,CD133阳性癌干细胞亚群比例还有所上升,提示癌干细胞更高的辐射抗性,而联合NU7026的处理组,CD133阳性癌干细胞亚群比例降低,有统计学意义。结论:实验发现在结肠癌HCT116细胞中,p53正调控癌干细胞表面蛋白标记物CD133的表达,与对其启动子的转录激活作用有关。NU7026能降低癌细胞受g射线照射后的癌干细胞亚群比例,对癌干细胞为优势亚群的结肠癌HCT116细胞具有明显的放射增敏作用,增敏机制是多方面,包括抑制DNA修复、诱发不可逆G2/M期阻滞、增加细胞凋亡发生。