棒曲霉(Aspergillus clavatus)是一种常见的土壤真菌,广泛分布于气候较暖的土壤中,它也广泛地分布在一些食物中,为小型丝状真菌,属于曲霉属的真菌。棒曲霉在室内的环境中其实并不常见,然而,它经常与酿酒业联系在一起。能够在查氏培养基、PDA等上培养。棒曲霉代谢可以产生多种生物活性物质。有丰富的胞内胞外水解酶活性。其次生代谢产物能够对真菌细菌产生一定作用的抑制,如展青霉素等。展青霉素又叫棒曲霉素,具有广谱的抗生素特点。现阶段,对于棒曲霉的研究大多是其代谢方面相关。而对于产孢相关基因方面的研究还很少。本课题把本实验保藏的棒曲霉Ac-32作为研究材料,主要的研究内容及结果如下所示。第一,克隆及分析flbA(分生孢子形成相关基因)。依照NCBI中提供的flbA基因序列,采用Primer 5.0软件设计引物,然后,进行PCR扩增,将PCR所得的产物进行凝胶电泳并对目的条带进行割胶回收。DNA片段进行测序,对编码蛋白的三级结构以及结构信息进行分析。基因长度2208 bp,核苷酸序列与构巢曲霉的相似性为69.9%,黑曲霉为68.1%,比对棒曲霉、黑曲霉、构巢曲霉序列发现同源序列低。flbA基因编码734个氨基酸;与构巢曲霉flbA编码的氨基酸序列同源性为76.6%,与黑曲霉flbA编码的为81.6%,三者氨基酸序列进行比对,其同源性高达72.6%,且存在几个保守区域。第二,根癌农杆菌介导的棒曲霉转化体系的构建。所用菌种和质粒分别是棒曲霉Ac-32、根癌农杆菌AGL-1和pKD1质粒。制备棒曲霉分生孢子悬浮液,活化及诱导培养根癌农杆菌。共培养后,利用潮霉素B抗性平板筛选转化子、再进行PCR和Southern杂交验证分析。再对转化子形态及显微结构变化进行分析。最后优化影响转化效率的因素,转化的过程中不同的条件对转化效率有很大影响。共培养时间和温度最适分别为2 d,32oC。波长600nm处的吸光值是0.6的时候,是最佳的农杆菌浓度,AS浓度为300μmol/L。这些优化实验为后续基因敲除奠定了基础。第三,构建棒曲霉flbA基因敲除载体。扩增潮霉素磷酸转移酶基因(hph),flbA基因5’端侧翼序列,3’端侧翼序列。利用双接头PCR(Double-joint PCR)技术连接这三个基因片段。最后用T4 DNA连接酶连接双酶切后得到的线性pKO1B质粒和flbA基因敲除盒。棒曲霉flbA基因敲除载体转化至农杆菌中得到flbA基因敲除载体。第四,棒曲霉flbA基因的敲除及基因缺失突变株的生长和代谢分析。通过农杆菌介导法,把敲除载体转化至棒曲霉细胞内,经验证成功得到一株棒曲霉flbA基因敲除菌株。再分析其菌落形态及显微结构,并分析了其分生孢子形成、生长及代谢的变化。发现flbA基因调控分生孢子形成,flbA基因缺失后,分生孢子不能正常形成。并且对于棒曲霉的生长和次级代谢也有一定的影响。在PDA培养基上flbA基因缺失突变株的生长速率有所减慢。水解酶活性也有所变化,棒曲霉flbA基因缺失突变株的蛋白酶和淀粉活性均有所增加。通过HPLC分析,相比较于野生型棒曲霉,棒曲霉flbA基因缺失突变株洛伐他汀的产量增高25.3%,棒曲霉素产量降低了7.8%。所以flbA基因对其生长和代谢有某种程度影响。