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目的体外扩增弓形虫RH株膜表面主要抗原SAG1编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,并表达出SAG1重组蛋白;分别诱导表达本实验室保种的pET28a/HXGPRT/ BL21和pET28a/AK/ BL21工程菌,制备并分别纯化出重组蛋白HXGPRT和AK;将三种重组蛋白联合应用,建立间接(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA方法诊断弓形虫病。方法复苏本室液氮保种的弓形虫RH株速殖子,腹腔接种昆明小鼠,转种三代后,抽取腹水,收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取DNA;设计合成SAG1引物,并在其中引入EcoRI和Hind III酶切位点;然后以该引物为模板扩增出SAG1编码基因;将目的基因SAG1插入克隆载体pGEM-T,对pGEM-T/ SAG1重组子进行双酶切、PCR和测序鉴定后,对阳性克隆提取重组质粒,经EcoRI和Hind III双酶切获得目的基因片断;将双酶切后获得的目的片断插入原核表达质粒pET28a中,转化入E.coli BL21;对pET28a/ SAG1/ BL21重组子双酶切、PCR和测序鉴定,并以IPTG诱导表达出rSAG1;同时分别用IPTG诱导表达本实验室构建保种的pET28a/HXGPRT/ BL21和pET28a/AK/ BL21工程菌,表达出rHXGPRT和rAK。分别用亲和层析法纯化重组蛋白抗原,用SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,考马斯亮蓝法测定纯化rSAG1、rHXGPRT和rAK蛋白浓度。分别用纯化的rSAG1、rHXGPRT和rAK蛋白包被聚苯乙烯酶标板,棋盘滴定确定最适抗原包被浓度、血清稀释度和酶标二抗稀释度,建立单一重组抗原间接ELISA方法;然后按照单一重组抗原最适包被浓度,将三种重组抗原1:1:1混合,棋盘滴定确定最适血清稀释度和酶标二抗稀释度,建立联合重组抗原间接ELISA [(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA]诊断弓形虫病。分析(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA的板间和板内差异,该检测方法的敏感性、特异性和cut-off值;按照建立的方法检测弓形虫Prugniaud株脑组织免疫前后的兔血清和用美国Biocheck公司生产的弓形虫IgG检测试剂盒(批号:RN28085)筛查后的阳性和阴性人血清。结果经PCR从弓形虫RH株DNA中扩增出一具有1011bp的SAG1目标基因片段,成功地将其克隆入pET28a。pET28a/ SAG1经EcoRI和Hind III双酶切,获得与目标基因大小相一致的基因片段。测序结果表明具有完整开放读码框,且无有意义的突变,与GenBank比对同源性为99%。用IPTG分别诱导表达pET28a/ SAG1/ BL21和本实验室保种的重组质粒pET28a/HXGPRT/ BL21和pET28a/AK/ BL21,证实构建和保种的质粒均能表达。SAG1诱导后以包涵体形式表达重组蛋白,经8M尿素Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rSAG1蛋白;用Ni2+亲和层析法分别纯化出rHXGPRT和rAK;用SDS-PAGE检测其分子量与预期分子量大小相符。Western blotting显示: rSAG1、rHXGPRT和rAK能够被Torch-ELISA试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别。以rSAG1、rHXGPRT和rAK联合应用作为抗原,建立了联合重组抗原(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA诊断弓形虫病的方法,经过优化ELISA检测条件,cut-off值OD450为0.05。(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA检测人血清最佳检测条件为:rSAG1包被浓度为500ng/ml、rHXGPRT包被浓度为200ng/ml和rAK包被浓度为200ng/ml;血清稀释度为1:20;酶标记羊抗人IgG稀释度为1:2000;灵敏度检测表明人血清稀释度在1:200均可检出阳性,特异性试验的抑制率为72.36%,变异系数11.2%。联合重组抗原ELISA检测兔血清最佳检测条件为:rSAG1包被浓度为500ng/ml、rHXGPRT包被浓度为200ng/ml和rAK包被浓度为100ng/ml,兔血清稀释度为1:2000;检测结果变异系数为10.05%,感染兔血清稀释度在1:10000均示阳性,特异性试验的抑制率为75.31%。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了SAG1基因,构建了pET28a/SAG1重组质粒,并获得了高效表达;(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA及Western blotting表明,rSAG1、rHXGPRT和rAK在弓形虫感染诊断中具有实用价值。本研究为弓形虫病的免疫学诊断和诊断试剂的标准化研究创造了条件。