论文部分内容阅读
在IVC操作过程中,因不能完全模拟胚胎在体内的生长环境,所以导致胚胎长期暴露于OS条件下,由此得知,OS是影响IVC胚胎质和量的关键性因素之一。综前人所述,向培养液中添加抗氧化剂无疑是减少OS最直接有效的方法,但OS问题仍然严重制约着胚胎IVC技术。已有研究表明,TP、ALC和NAC都对OS胚胎有着抗氧化作用,只是它们分别作用于氧化-还原反应体系的不同阶段,如TP能有效促进SOD和CAT等抗氧化酶的表达,NAC可提高GPx酶的活性,ALC却能加速为体内反应提供能量的ATP的生产。总之,这三种抗氧化剂的作用发挥于氧化-还原体系的不同环节。TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合添加是否比单独添加其中一种或不添加任何抗氧化剂更能改善IVC过程中小鼠早期胚胎的质量和数量,以及它对胚胎内源性氧化-还原反应体系有什么影响?试验分为5组:阴性对照组、阳性对照组(包括TP处理组、ALC处理组和NAC处理组)、组合处理组。对IVC胚胎质和量的评估,本试验选取三种抗氧化剂单独或组合添加,通过对上述五组的胚胎相关指标(如2-细胞发育率、4-细胞发育率和囊胚发育率)的观测,来验证TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合添加的胚胎比单独添加其中一种或不添加任何抗氧化剂的发育状态好;对胚胎内氧化-还原反应体系影响的研究,本试验通过检测上述五组胚胎中囊胚的内源性氧化酶基因、抗氧化酶基因和抗氧化酶关键调节因子Nrf2基因的表达,来探究TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合添加对氧化-还原反应体系的影响;此外,通过对上述五组囊胚内ROS和GSH水平的对比,进一步证明TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合添加具有更佳的抗氧化效果。通过qRT-PCR法检测胚胎内源基因的表达,并采用2’ 7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)染色法和4-氯甲基-6,8-二氟-7-羟基香豆素(CMF2HC)染色法分别测定胚胎内部的ROS和GSH水平。主要试验结果:胚胎经不同浓度的TP、ALC和NAC处理后发现,5 μ M TP处理组的4-细胞发育率(P<0.05)和囊胚发育率(P<0.01)均高于对照组,10 μM ALC处理组的4-细胞发育率(P>0.05)和囊胚发育率(P<0.01)均高于对照组,10 μM NAC处理组的4-细胞发育率(P<0.01)和囊胚发育率(P<0.01)均高于对照组;TP、ALC和NAC组合添加组的4-细胞发育率和囊胚发育率均显著高于TP、ALC、NAC单独添加组的(P<0.05),并极显著高于对照组(P<0.01);TP、ALC和NAC组合添加组能高效地上调胚胎内部氧化酶(NOX1、NOX2、NOX4、Duox1、Duox2)基因的表达,也能有效促进胚胎内部抗氧化酶(SOD1、SOD2、CAT、GPx1、GPx2 和 GPx4)基因的表达;此外,TP、ALC 和 NAC 组合添加组还能上调胚胎内部Nrf2基因的表达(P<0.01);TP、ALC和NAC组合添加组的ROS水平显著下降(P<0.01),而GSH水平显著升高(P<0.01)。以上结果表明,在体外培养液中补充三种有协同作用的抗氧化剂,可进一步利于维持IVC胚胎在体外的生存和发育能力,易于联想,这些现象可能是通过减弱OS来实现的。