第一部分 IRF-3基因沉默对骨髓树突状细胞生物免疫学功能的影响研究　　 目的：　　 树突状细胞(Dendritic cell，DC)具有激活免疫应答或诱导免疫耐受的功能，未成熟状态的树突状细胞倾向于诱导免疫耐受产生，被称为致耐受DC(tolerogenicdendritic cell，Tol DC)。本实验在成功建立体外扩增高纯度小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell，BM-DC)方法的基础上，利用最新的RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)针对DC成熟的依赖途径中关键基因IRF-3基因，筛选出最佳的shRNA PCR表达框序列，用于构建IRF-3基因沉默的RNAi-IRF-3-DC，并从细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫功能等方面对RNAi-IRF-3-DC的生物免疫学特性进行了比较研究，以期构建出IRF-3基因沉默的全新致耐受DC，RNAi-IRF-3-DC，验证其诱导T细胞免疫耐受特性及可能机制，为其成功用于治疗移植排斥反应及自身免疫性疾病提供可靠的理论和实验依据。　　 方法：　　 1、小鼠骨髓DC的体外培养与鉴定研究分离C57BL/6小鼠骨髓前体细胞，在重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素-4(rmIL-4)刺激下，贴壁筛选方法，培养扩增骨髓来源DC(BM-DC)，并通过TNF-α刺激诱导DC成熟。实验分成两组：①Control-DC组：手法筛选的第8天的DC细胞，即未成熟DC组；②TNF-α-DC组：在培养结束前48h(第6天)加入TNF-α刺激的DC细胞，即成熟DC组。分别从细胞形态、细胞表面分子表达以及混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction MLR)等方面鉴定体外培养的未成熟DC与成熟DC。　　 2、树突状细胞IRF-3基因沉默及效果检测研究根据shRNA设计原则预先设计3段IRF-3 shRNA序列，采用金思特公司PCR表达框试剂盒，构建出相应的3种IRF-3shRNA表达框(R1/shRNA、R2/shRNA、R3/shRNA)，转染体外培养的成熟DC。实验分为六组：①Control-DC组；②TNF-α-DC组；③R1/shRNA转染组：用R1/shRNA转染成熟DC；R2/shRNA转染组：用R2/shRNA转染成熟DC；⑤R3/shRNA转染组：用R3/shRNA转染成熟DC；⑥GFP/shRNA转染组：用GFP/shRNA转染成熟DC，也即本实验的阴性对照组)。采用RT-PCR分别在mRNA水平检测比较各组DC的IRF-3基因表达情况，筛选出IRF-3基因沉默效果最好的有效shRNA序列。　　 3、IRF-3基因沉默对树突状细胞的生物免疫学功能影响研究成功构建shRNA-IRF-3 DC基础上，实验分成四组：①Control-DC组；②TNF-α-DC组；③IRF-3基因沉默组(shRNA-IRF-3-DC)：第6天经过IRF-3 shRNA处理的培养第8天的DC；④TNF-α刺激的IRF-3基因沉默组(TNF-α-shRNA-IRF-3-DC)第6天经过IRF-3 shRNA处理和结束前加入TNF-α(15ng/mL)刺激48h的培养第8天收集的DC。分别从细胞形态、细胞表面分子表达、混合淋巴细胞反应等方面对shRNA-IRF-3 DC的生物免疫学特性进行了比较研究。　　 结果：　　 1、在rmGM-CSF和rmIL-4诱导下，可从小鼠骨髓培养扩增出大量DC。每只小鼠获得BM-DC约1-2×107个，完全满足实验需要。　　 2、Control-DC组细胞形态多为圆形、皱褶多、突起较少、细胞器也少。胞内较多吞饮泡，细胞表型检测MHCⅡ类分子低水平表达，共刺激分子低表达(CD80、CD86)，MLR表明该类DC刺激同种异基因T细胞增殖能力较弱，表现出未成熟DC的特点。TNF-α-DC组细胞经TNF-α刺激后，DC胞内囊泡结构减少，线粒体，粗面、滑面内质网等细胞器均显著增多，表面有大量细长的树枝状突起。与Control-DC相比，细胞表面共刺激分子呈高水平表达，刺激T细胞增殖能力显著增强(P<0.001)，呈现成熟DC特征。　　 3、PCR表达框方法可以得到设计好的针对IRF-3基因3个不同位点的IRF-3shRNA，可用于骨髓未成熟DC的转染实验。RT-PCR显示，与另外两个位点相比，R2/shRNA可以明显抑制细胞IRF-3基因表达(P<0.001)。　　 4、shRNA-IRF-3 DC形态为圆形或椭圆性、胞内有大量囊泡结构、部分囊泡可见吞噬的异物、细胞核多偏向一侧、溶酶体和线粒体等细胞器少、表面突起少、形态较规则；细胞表达CD86、CD80表面分子较低。　　 5、shRNA-IRF-3 DC刺激T细胞增殖能力较Control-DC大致相同(P值>0.05)；TNF-α刺激后shRNA-IRF-3-DC刺激T细胞增殖能力未见明显增高，与TNF-α-DC组DC的MLR能力差异仍有显著性(P<0.001)。　　 结论：　　 1、小鼠骨髓前体细胞在rmGM-CSF和rmIL-4诱导下，可扩增到大量的DC。　　 2、手法筛选可以得到85％以上纯度的DC，适合应用于DC的分子免疫学研究。　　 3、R2/shRNA PCR表达框转染DC可以在mRNA和蛋白质水平明显抑制细胞IRF-3基因表达，不影响细胞活力和形态，是最佳的候选shRNA靶位点，适合用于构建shRNA-IRF-3 DC。　　 4、shRNA-IRF-3-DC在细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫学功能等方面与未成熟DC相似，具有致耐受DC特性，有望用于治疗移植排斥反应及自身免疫性疾病的防治。