昆虫病原真菌具有对环境无害、寄主范围广、可在适当时候形成流行病等特点,已被广泛应用于农林害虫及城市卫生昆虫的生物防治。但其致死宿主速度慢(4-14d)、对环境条件要求高等缺点严重制约了真菌杀虫剂的推广和应用。真菌致病昆虫的过程包括孢子附着昆虫体壁、侵染结构形成、菌丝穿透体壁、真菌在宿主血腔中增殖并击倒宿主几个步骤。在此过程中,昆虫会利用其免疫系统进行积极的防御,产生吞噬、黑化及抗菌肽合成等免疫反应,抑制及清除入侵的病原物。研究表明,Toll信号途径是昆虫应对真菌侵染的主要信号通路。当真菌侵染宿主时,会激活体内的Spaetzle蛋白,进而活化Toll受体,引起相应的免疫反应。该信号途径受到丝氨酸蛋白酶抑制子(serpin)的负调控。在果蝇中,当缺乏serpin (Spn43Ac)时,会引起Toll介导免疫反应的组成性活化。因此,我们设想,将免疫负调控因子serpin导入到昆虫病原真菌中表达,使其在真菌侵染宿主的过程中抑制宿主的免疫反应,提高真菌在宿主中的增殖速度,从而增强真菌的杀虫效果。为此,课题组克隆了果蝇的Spn43Ac基因,构建了相应的真菌表达载体,经遗传转化后获得了球孢白僵菌Bbsp:Spn43Ac菌株,同时获得大肠杆菌异源表达Spn43Ac蛋白,进行了相应的菌株毒力分析及相关反应机理研究,得到的主要研究结果如下：1. Bbsp:Spn43Ac真菌表达载体的构建利用PCR互搭的方法去除果蝇Spn43Ac基因的内含子,获得Spn43Ac的cDNA序列,并将其与球孢白僵菌几丁质酶Bbchitl的信号肽(分泌型)相融合,获得融合基因Bbsp:Spn43Ac。将该融合基因构建进真菌表达载体,通过农杆菌介导法转入球孢白僵菌中,经筛选及实时定量PCR分析获得Bbsp:Spn43Ac表达菌株。2. Bbsp:Spn43Ac菌株生物测定我们以大蜡螟和蚜虫为试虫对转基因菌株进行了毒力测定。在3×107孢子/mL条件下,Bbsp:Spn43Ac菌株对大蜡螟的半致死时间(LT5o)为84h,较野生型(110h)缩短了24%；以蚜虫为试虫,同样观察到转基因菌株LTso的降低(1×107孢子/mL,98hvs117h)。此外,以大蜡螟为试虫,转基因菌株的半致死浓度(LDs0)也较野生型菌株显著降低了2倍(2×107vs6×107)。上述结果表明,在球孢白僵菌中超量表达Bbsp:Spn43Ac可以显著提高菌株的毒力。3. Bbsp:Spn43Ac菌株毒力提高机制分析1)表达Bbsp:Spn43Ac不会影响菌株的生长真菌在宿主体壁上的生长和萌发是其侵染致病的一个关键步骤,在此过程中,真菌会产生蛋白酶降解宿主体壁。Spn43Ac是否会对真菌降解宿主体壁蛋白酶的活性及菌株的生长产生影响呢?我们的结果表明,在球孢白僵菌中表达Bbsp:Spn43Ac不会影响真菌在人工培养基及在蝉翅上的萌发与生长。体外实验表明,Spn43Ac蛋白对球孢白僵菌降解体壁蛋白酶CDEP-1的活性也无影响。2)表达Bbsp:Spn43Ac加快昆虫血淋巴中虫菌体的生长真菌侵染宿主后,能在宿主血腔中以虫菌体的形式存在。显微观察发现,Bbsp:Spn43Ac-1菌株在接种后84h已在大蜡螟血淋巴中大量增殖,但接种野生型菌株后血淋巴中只有少量虫菌体。在侵染后108h,Bbsp:Spn43Ac菌株的虫菌体数约为野生型的2.4倍(6.6x106vs2.8x106)。虫菌体在血淋巴中的大量繁殖,会过度消耗宿主的养分,从而使试虫快速死亡。因此,Bbsp:Spn43Ac菌株在宿主血腔中的繁殖速度快于野生型菌株,这可能是导致转基因球孢白僵菌菌株毒力提高的因素之一。3)表达Bbsp:Spn43Ac抑制昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)活性酚氧化酶级联反应是昆虫免疫系统的主要反应之一,本研究检测了在球孢白僵菌中表达Spn43Ac对PO活化的影响。结果显示,注射Bbsp:Spn43Ac孢子后大蜡螟血淋巴酚氧化酶活性较注射野生型孢子普遍降低。注射后8h,Bbsp:Spn43Ac菌株处理大蜡螟的酚氧化酶酶活性较野生型处理降低了33%(p<0.01)。4) GST:Spn43Ac蛋白对酚氧化酶(PO)活性的影响在大肠杆菌中表达、纯化了GST:Spn43Ac蛋白。以大蜡螟血淋巴为待测酶液,添加单独的GST蛋白对PO活性无影响,而添加GST:Spn43Ac蛋白能抑制PO的活化,且蛋白浓度越高,抑制活性越强。但将GST:Spn43Ac热失活后,抑制活性消失。这表明,添加Spn43Ac蛋白对PO活性有抑制作用,并与蛋白浓度成正比。本研究通过在昆虫病原真菌中表达宿主免疫反应负调控因子,抑制了宿主的酚氧化酶活性,提高了真菌在宿主中的增殖速率,从而增强了菌株毒力。研究结果为利用基因工程改良杀虫真菌菌株和筛选高效毒力因子提供了新的思路。