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背景与目的近视眼是眼科的常见病、多发病,影响患者的工作、学习和生活,发病率逐年上升,已成为全球性社会问题。对于近视的研究已有200多年的历史,但其发病机制尚无定论。因此,阐明近视的发病机制日益成为生命科学领域急需解决的一大难题。20世纪后30年内近视的动物实验研究取得了巨大进展,确立了两种近视的动物实验模型,即:形觉剥夺性近视（form deprivation myopia,FDM）,指用缝合眼睑或戴弥散镜片严重破坏动物的形体觉所引起的近视。离焦性近视（defocus myopia）,指强迫动物视近或戴负球镜片使物体聚焦于视网膜后方,从而引起调节和眼轴延长,以致造成近视。自建立动物近视模型以来,人们对近视的发生、发展及转归有了更深入的研究。研究中发现诱导近视发生的物质主要来自视网膜神经上皮。视网膜神经上皮产生的一级信使首先作用于视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞和葡萄膜细胞,使之产生的下一级生化物质（称为二级信使）,再作用于巩膜,调控巩膜生长,导致巩膜重塑,眼轴延长。一些自分泌或旁分泌环路涉及的细胞因子、生长因子及其酪氨酸激酶受体可能对RPE细胞的病理改变起重要作用。全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,ATRA）是维生素A的衍生物,能有效的调节细胞分化和发育。ATRA具有致畸性,并且是眼球发育的重要因子。研究表明,ATRA对于视网膜、巩膜的发育及特定细胞类型（如感受器细胞、无长突细胞）的分化和成熟具有重要的影响。已知视网膜内层的无长突细胞参与了ATRA的代谢,而视网膜无长突细胞位于视网膜图像加工过程的输出端,这种加工过程的输出与视觉控制眼球生长有关。近年来研究表明,ATRA对RPE细胞的增生有抑制作用,类似近视眼病理改变。在已知的近视信使中bFGF与TGF-β近年来研究较为深入,然而能影响眼球生长的肝细胞生长因子（hepatocytegrowth factor,HGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）则研究较少。本研究拟建立RPE细胞近视模型,从细胞的微观角度来定性定量观察ATRA在体外诱导RPE细胞在近视改变中的作用,应用免疫细胞化学法测定RPE细胞内HGF、MMP-2的表达,用ELISA法测定RPE细胞中HGF的分泌量,以探讨ATRA抑制RPE细胞的机制,以及在此作用下近视相关因子HGF、MMP-2的变化情况及关系。材料与方法1.选取健康1周龄黑色家兔12只,麻醉后在无菌条件下取双眼球,距角膜缘后2mm环形剪开并去除眼前段组织及玻璃体,将眼后段制成眼杯并固定,用0.25%Trypsin+0.02%EDTA约2ml室温消化3min,吸出消化下来的神经上皮层,再加入胰蛋白酶于37℃、5%CO2的培养箱消化15min,加入含FBS的DMEM终止消化,吸管轻轻吹打使RPE细胞脱落,收集细胞悬液于离心管中离心5min,加入含20%FBS的DMEM接种于培养瓶中,于细胞培养箱中原代培养。以此法传代至第3-5代可用于实验研究。2.应用波形蛋白和角蛋白多克隆抗体,免疫细胞化学染色法鉴定RPE细胞。3.在RPE细胞生长的不同时间点（24h、48h、72h）,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA,应用台盼蓝排斥实验测定ATRA作用后的RPE细胞生存率。4.在RPE细胞生长的不同时间点,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml浓度的ATRA,应用免疫细胞化学染色法测定RPE细胞内近视相关因子HGF、MMP-2的表达。5.在RPE细胞生长的不同时间点,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml浓度的ATRA,应用酶联免疫吸附试验法测定RPE细胞中HGF分泌量。6.采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析,测试指标数据用（?）±s表示,不同浓度ARTA组在各处理时间点的RPE细胞活力比较采用x2检验。对不同时间和不同ARTA浓度组的RPE细胞分泌HGF量的比较采用两因素方差分析,各时间点间和各浓度组间的多重比较采用LSD-t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1.成功建立RPE细胞培养模型,观察正常RPE细胞形态学特征:RPE细胞呈椭圆形或不规则多角形,常可看到白色透明的胞核核仁,细胞质内布满丰富的黑色素颗粒,环绕细胞核以同心圆状分布。2.ATRA作用后RPE细胞形态学特征:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA均能抑制RPE细胞的增生,细胞增大扁平,突起减少,色素弥散。不同浓度的ATRA作用24h、48h、72h后RPE细胞均有增大扁平,突起减少,部分裂解,活力减弱的表现。3.台盼蓝排斥实验提示:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA作用24h后细胞存活率分别为99.50%、91.67%和87.44%（x2=10.80,P=0.002）;48h后细胞存活率分别为99.02%、88.17%和80.44%（x2=18.59,P＜0.001）;72h后细胞存活率分别为98.44%、86.94%和71.08%（x2=29.46,P＜0.001）。4.免疫细胞化学染色法检测HGF和MMP-2的表达提示:RPE细胞中HGF、MMP-2的阳性表达位于RPE细胞的细胞质中,阳性表达随ATRA的浓度增高而增加,随ATRA作用时间延长亦增加。在相同浓度和作用时间HGF的阳性表达比MMP-2的阳性表达更明显。5.ELISA检测HGF分泌量提示:RPE细胞分泌HGF的量随ATRA的浓度增高而增加,任意两组比较均有P＜0.05。ARTA作用时间长短对RPE细胞分泌HGF的量影响不大,任意两组比较均有P＞0.05。结论1.ATRA的浓度≥5 nmol/mL可引起RPE细胞的生长抑制,存活率降低,类似于近视眼RPE细胞改变。2.ATRA作用下RPE细胞中HGF、MMP-2表达增加,且HGF的增加更明显。