论文部分内容阅读
目的:自噬在神经退行性疾病中扮演着重要的角色。本研究考察囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAPB)是否参与自噬调控及其机制研究。方法:我们分别在HEK293T、HeLa和SH-SY5Y三种细胞系中,转染了两种VAPB干扰小RNA来沉默VAPB的表达,利用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中LC3和Beclin 1的蛋白水平。在HEK293T细胞中过表达FLAG-VAPB,检测细胞中的LC3和Beclin 1的蛋白水平。在HEK293中敲减VAPB,同时过表达GFP-LC3和FLAG-P62,通过免疫荧光的方法,检测GFP-LC3和FLAG-P62的共定位情况。在HEK293T细胞中沉默VAPB的表达,通过实时定量PCR(Real-time q PCR)检测Beclin1 m RNA水平的变化。在HEK293T细胞中同时沉默VAPB和Beclin 1的表达,检测细胞中的LC3蛋白水平。在m Cherry-LC3稳定转染的HEK293细胞中,同时沉默VAPB和Beclin 1的表达,检测细胞中m Cherry-LC3点状聚集的数量。在HeLa细胞中,敲减VAPB后过表达m Cherry-EGFP-LC3B,另一组加入自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf A1),最后在荧光显微镜下检测Cherry和GFP的点状聚集。在HEK293细胞中过表达GFP-HTT60、m Cherry-LC3和FLAG-P62,或者RFP-SOD1-G93A、GFP-LC3和FLAG-P62,通过免疫荧光的方法,检测三种蛋白的共定位情况。在HEK293细胞中敲减VAPB,然后过表达GFP-HTT60或RFP-SOD1-G93A,并加入蛋白酶体抑制剂MG132或自噬抑制剂Baf A1,在荧光显微镜下检测这些的点状聚集数量。结果:在HEK293T、HeLa和SH-SY5Y三种细胞系中,敲减VAPB显著地上调了LC3Ⅱ和Beclin 1的蛋白水平,而在HEK293T中过表达FLAG-VAPB则导致了LC3Ⅱ和Beclin 1的蛋白水平的下降。在HEK293中敲减VAPB后,GFP-LC3和FLAG-P62的共定位增多。敲减VAPB后,Beclin 1的m RNA水平增加。在敲减Beclin 1后,敲减VAPB则LC3Ⅱ水平和m Cherry-LC3的点状聚集不再增加。在HeLa细胞中敲减VAPB后转染m Cherry-EGFP-LC3B,我们发现红色荧光比黄色荧光的比值有所增加,这说明自噬流增强;敲减VAPB后,加入100 n M Baf A1处理4小时后,黄色荧光点的数量增多,这再次表明敲减VAPB起始自噬。在HEK293细胞中过表达GFP-HTT60、m Cherry-LC3和FLAG-P62,或者RFP-SOD1-G93A、GFP-LC3和FLAG-P62,这三个蛋白有共定位,说明GFP-HTT60或RFP-SOD1-G93A均与自噬体共定位。在HEK293细胞中敲减VAPB后,GFP-HTT60和RFP-SOD1-G93A的聚集在转染细胞中的比例下降,这说明RFP-SOD1-G93A或者GFP-HTT60的降解增加。在用MG132处理细胞后,这种蛋白聚集下降的现象仍然可见,而在用Baf A1处理细胞后,该现象消失,这说明GFP-HTT60和RFP-SOD1-G93A聚集体的降解与VAPB敲减所诱导的自噬有关。结论:敲减VAPB可以上调Beclin 1的转录表达,进而诱导自噬。VAPB缺失所诱导的自噬是依赖于Beclin 1的。VAPB敲减增强自噬流,并促进易聚集蛋白GFP-HTT60和RFP-SOD1-G93A的降解。