分枝杆菌是一类特殊的放线菌,包括能引起结核病的致病性结核分枝杆菌以及无致病性的耻垢分枝杆菌等。环境压力是细菌生存必须面临的外界条件,而结核分枝杆菌在其感染过程中主要需要面对的环境压力则有药物和缺氧。当前有关分枝杆菌适应这些压力的分子机制和信号通路还很不清楚。本论文以模式分枝杆菌为研究对象,研究了它们适应抗结核药物异烟肼和缺氧两种胁迫的分子机制,取得了以下结果:(1)在耻垢分枝杆菌中发现和解析一条由三个转录因子共同介导的生物膜形成调控信号通路,阐明了分枝杆菌应对异烟肼(INH)胁迫的一个自我保护新机制。实验室前期研究发现Ms0179是一个能增强分枝杆菌INH抗性的GntR家族转录因子,本研究证实了这一结果,并发现Ms0179表达明显受到INH的诱导。在此基础上,本研究还发现Ms0179正调控其在基因组中相邻的转录因子Ms0180的表达,且证实在耻垢分枝杆菌中分别超表达Ms0179和Ms0180基因,菌体中的mmt(mannitol metabolism and transportation)操纵子(由Ms5571-Ms5576基因簇编码)均上调表达。进一步研究发现Ms0180蛋白能直接与mmt操纵子上游调控序列结合,并能显著促进分枝杆菌INH抗性,同时还能促进生物膜的形成。超表达mmt操纵子基因同样能增强分枝杆菌对INH的抗性和增加细菌生物膜的形成。分枝杆菌生物膜能增强其药物抗性,表明Ms0179确实是通过Ms0180来调控mmt操纵子,增加细菌生物膜,从而促进分枝杆菌应对异烟肼的胁迫。研究还发现mmt操纵子中的Ms5575编码一个负调控转录因子抑制mmt操纵子的表达,而Ms5576基因则编码甘露醇-2-脱氢酶,能代谢D-甘露糖为D-甘露醇,其作为效应分子解除Ms5575对mmt操纵子的阻遏,表明mmt操纵子有一个自身调控的过程。因此,本研究在耻垢分枝杆菌中发现和鉴定一个响应异烟肼胁迫的调控回路,解析了生物膜和药物抗性形成调控的信号通路。(2)发现分枝杆菌在面对缺氧胁迫时,通过诱导还原型rTCA循环途径相关酶的表达来提高细菌在缺氧环境下生存能力的新机制。研究首先检测了缺氧条件下分枝杆菌M.bovis BCG和M.tuberculosis H37Ra中citE以及rTCA循环关键基因korA和korB的表达情况,发现这些基因均显著上调表达。随后的研究中证实了结核分枝杆菌的MtbCitE是一个柠檬酸裂解酶,其多个氨基酸残基如Glu36、Asp37、Arg64、Glu112和Asp138在MtbCitE的柠檬酸裂解活性中发挥重要作用。通过分析MtbCitE与ATP的共结晶衍射图并结合实验研究,发现ATP能够显著抑制MtbCitE的柠檬酸裂解酶活性,表明细菌的能量代谢偶联调控MtbCitE的功能。进一步通过比较缺氧条件下BCG的citE敲除菌株、超表达菌株和野生型菌株生存情况,证实citE有利于BCG在缺氧条件下的存活。BCG菌株感染巨噬细胞的实验发现citE敲除菌株存活能力相对野生型降低,表明citE明显有利于BCG在宿主细胞内的存活。综合以上结果,我们认为结核分枝杆菌中柠檬酸裂解酶CitE在细菌适应缺氧和细胞感染过程中的关键作用,该结果进一步增强了对分枝杆菌适应缺氧压力的分子机制的理解,为开发新型抗结核治疗方法提供了潜在靶标。