[研究背景]世界首例试管婴儿于1978年出生,自此后体外受精—胚胎移植(IVF-ET)技术已在世界范围内普遍开展,尽管其应用广泛,但低成功率和高多胎妊娠率仍然是目前人们难以应对的难题。据最近的辅助生殖协会统计,在辅助生殖技术(ART)中多胎率达到40%。多胎妊娠导致较高的母婴并发症,比如早产、胎膜早破、产前出血、妊高症等,威胁母婴安全。近几年,ART安全性日益得到重视,很多国家开始限制移植入宫腔的胚胎个数。美国生殖医学协会建议,对超排卵有足够反应的妇女一次移植胚胎数不超过2个,以减少多胎妊娠的发生率。移植多个胚胎是ART中多胎妊娠最主要的原因。单胚胎移植是降低多胎妊娠率的一种有效方法。欧洲已有不少学者对选择性单胚胎移植进行了尝试。我国也有中心对单胚胎移植的妊娠结局及可行性进行探讨,认为IVF-ET周期选择取卵后第三天的优质胚胎或囊胚期行单胚胎移植,可达到相对较高的妊娠率并减少多胎妊娠的发生。但是由于缺乏评估胚胎发育活力的有效方法,所以进行单胚胎移植会遇到来自医生和患者两方面的压力。卵裂期胚胎发育潜能的评估是保证人类辅助生殖技术成功率的关键环节。但是目前广泛采用的判断胚胎发育潜能的唯一方法是形态学评估的方法。形态学评估无损伤性,但是这种方法具有一定的局限性,常常会发现形态学评分与胚胎后续的发育情况不符合。进行囊胚培养也是评价胚胎发育潜能,筛选胚胎的有效手段,但是由于卵裂期胚胎能够发育到囊胚的比例尚不理想,进行囊胚培养有可能失去移植机会,所以绝大多数中心仍然采用卵裂期胚胎移植。为此研究者进行了大量研究。有学者认为,胚胎代谢分析可能会有效地选择优质胚胎。但是到目前为止,也还没有任何一种胚胎代谢参数被常规应用于临床作为选择优质胚胎的依据。如何准确预测早期胚胎的发育潜能,减少移植胚胎数目,改善胚胎种植率和临床妊娠率,同时又减少多胎妊娠,是ART的巨大挑战,尚需深入研究。胚胎代谢研究中常用的指标包括氨基酸、葡萄糖、丙酮酸的代谢情况,另外还有胚胎呼吸率、可溶性人白细胞抗原G、血小板活性因子、甚至瘦素等。近年的研究表明,氨基酸是胚胎培养过程中重要的调控因子。除充当细胞内生物合成的原料外,还参与碳水化合物代谢、渗透压以及细胞内pH值的调节等。氨基酸不但有利于维持细胞正常功能,而且能促进胚胎发育和分化,提高种植后胚胎的发育潜能。以往的研究中曾有报道部分种类的氨基酸可预测囊胚形成以及临床妊娠率及活产率。由于氨基酸在培养液中含量很低,因此方法学上采用HPLC的方法,但是由于检测耗时、费用高且对技术要求较高,难以实现临床应用。近年来出现的HPLC-MS技术能够快速检测微量样本中多种氨基酸的含量,为氨基酸代谢应用于胚胎选择带来了新的机会。[研究目的]1.通过动物实验,初步了解胚胎的氨基酸代谢与胚胎质量的关系。2.通过人类胚胎的氨基酸代谢情况,进一步了解人类胚胎氨基酸代谢与囊胚形成的关系。3.通过对人类囊胚形态参数的分析,来评估氨基酸代谢与囊胚质量的关系。[研究方法]1.动物试验部分a)对ICR品系的小鼠进行超促排卵,在受孕后2细胞阶段时处死小鼠,获取2细胞阶段的胚胎,每个胚胎在一个液滴内进行体外培养。b)在鼠胚的卵裂期阶段将胚胎移入囊胚培养液,收集废弃的卵裂期培养液,以及空白对照培养液,采用HPLC-MS测定样本中30种氨基酸的浓度。c)将形成囊胚的小鼠胚胎进行双重荧光染色,计数ICM和TE的细胞数,以此代表囊胚的质量。d)分析卵裂期培养液中氨基酸浓度的变化率与ICM和TE计数的关-系。e)将小鼠胚胎卵裂期的培养液内氨基酸浓度减去空白培养液的氨基酸浓度,用两者之差除以相应空白培养液的浓度之后,得到该氨基酸浓度的变化率。筛选出变化率较大的几种氨基酸,用其浓度的变化率分别与囊胚的ICM细胞数和TE细胞数进行多元逐步回归分析。2.人类胚胎的实验部分a)选择年龄介于25～35岁初次治疗因双侧输卵管不通进行体外受精治疗的患者。b)受精后胚胎进行培养,每个液滴(20u1)一个胚胎,移植后剩余的胚胎在卵裂期后转移至囊胚培养液继续培养,仍然为每液滴一个胚胎单独培养。c)收集患者的卵裂期培养液,并采用HPLC-MS的方法进行氨基酸浓度的测定。d)观察患者胚胎后续囊胚形成情况,并对形成的囊胚进行图像采集和形态参数的测量,包括：沿透明带圆周分布的TE细胞数、ICM的面积。用这两个参数代表人类囊胚的质量。e)每枚胚胎的培养液检测了30种氨基酸的浓度及10份相同条件下的空白液的培养液的浓度。用培养液中氨基酸浓度减去空白液中的同种氨基酸的浓度得出的差值的绝对值除以空白液的氨基酸浓度,得出氨基酸变化率。f) 采用logistic回归的方法分析氨基酸浓度变化率与囊胚形成之间的关系。g)采用多元逐步回归的方法分别分析氨基酸变化率与囊胚的ICM细胞数和TE细胞数之间的关系。[研究结果]1.动物试验部分：a)15只ICR雌鼠,经过超促排卵后,共获得503枚2细胞阶段的胚胎。每枚胚胎置入一个20u1的液滴中进行单胚胎培养,培养之后形成孵化期囊胚428枚,囊胚形成率为85.1%。b)经过胚胎培养后形成的孵化期小鼠囊胚均进行双重荧光染色。染色后在荧光显微镜下拍照并计数ICM和TE的细胞数。c)平均每枚胚胎的ICM细胞数21.92±4.23；平均每枚胚胎的TE细胞数83.69±18.96。d)经多元逐步回归分析,结果提示,谷氨酰胺的浓度变化率与TE的细胞数呈正相关。差异有统计学意义(P<0.05)。其余氨基酸浓度与孵化期囊胚的质量的两种参数间无明显相关性。2.人类胚胎实验部分：a)共收集14例患者受精后的胚胎,胚胎在卵裂期培养液滴内培养,每个液滴内放置一枚胚胎,取卵后第3天移植2枚胚胎后剩余胚胎转移入囊胚培养液滴,仍为每液滴一枚胚胎。检测废弃的卵裂期培养液滴内的30种氨基酸浓度。b)这67枚卵裂期胚胎继续囊胚培养后形成扩张期囊胚29枚。囊胚形成率为43.2%。c)对囊胚进行了图象采集后,进行形态学参数的测量。ICM面积平均为3637.79±3254.68 um2,在圆周上分布的TE细胞数平均为7.8±2.6个。d)将囊胚形成与否和卵裂期培养液内氨基酸浓度变化率进行Logistic回归分析。结果提示天门冬酰胺(Asn)的变化率对囊胚形成有最明显的影响,有统计学意义。对囊胚形成的预测作用由56.7%上升到70.1%。e)采用多元线性逐步回归分析发现,Asn的变化率与TE细胞数之间有最大的相关性,有统计学意义；而对于囊胚内细胞团的面积,最有相关性的氨基酸为Ala。[研究结论]1.采用HPLC-MS检测氨基酸浓度的方法来评价胚胎发育潜能,结果稳定可靠,重复性好,检测速度快,能够在胚胎移植当日得到检测结果,对正常的体外受精-胚胎移植治疗流程无影响,有应用于临床的可能性。2.小鼠卵裂期胚胎的谷氨酰胺变化率与囊胚的形态学质量有关。3.人类卵裂期胚胎氨基酸变化率与囊胚形成率有关,能提高预测囊胚形成的准确性。4.人类卵裂期胚胎氨基酸变化率与囊胚的TE细胞数和内细胞团大小有关,提示氨基酸代谢与囊胚质量有显著相关性。