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据报道,长非编码RNA参与骨肉瘤(OS,osteosarcoma)中的肿瘤发生和多种细胞过程;然而,lncRNA LINC00152在OS中的作用仍然难以捉摸。本次研究中,LINC00152在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系较正常癌旁组织与正常成骨细胞系相比明显高表达。而且,MTT和克隆形成检测显示,LINC00152的敲低显著抑制细胞增殖;transwell测定分析结果表明敲低LINC00152在瘤细胞中的表达,瘤细胞迁移和侵袭能力下降。另外,染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因检测分析表明LINC00152由转录因了TCF3转录激活。亚细胞分离实验结果显示,LINC00152主要位于OS细胞的细胞质中,进一步实验证明LINC00152作为竞争内源性RNA(ceRNA)发挥调控作用,通过调节miR-1182/CDK14轴实现对骨肉瘤细胞生物学行为调控。总的来说,LINC00152被TCF3激活,通过miR-1182/CDK14轴促进骨肉瘤中的细胞增殖、迁移和侵袭。目的1通过实时定量PCR检测LINC00152在在骨肉瘤的表达水平,瘤细胞转染sh-RNA敲低LINC00152表达,对转染后的瘤细胞进行功能检测,确定LINC00152敲低对OS细胞过程的影响,例如增殖,侵袭和迁移。2进一步分析LINC00152调控骨肉瘤生物学行为的上游和下游分子机制,揭示LINC00152在骨肉瘤进展中的作用机制和功能。材料与方法材料1组织样本从苏州大学附属第二医院的骨肉瘤患者收到84对骨肉瘤组织和邻近的正常组织(肿瘤组织距离>5 cm)。2四种骨肉瘤细胞系(U20S,MG-63,HOS,143B)和一种正常人胎儿成骨细胞系(hFOB)。使用Lipofectamine2000在MG-63和HOS细胞中进行质粒转染。为了敲低LINC00152表达,设计了针对LINC00152的短发夹RNA(shRNA)和阴性对照(sh-NC)。MiR-1182模拟物/抑制剂和pcDNA-CDK14以及它们的阴性对照。方法1 RNA分离和qRT-PCR:获得各个瘤细胞系及正常成骨细胞、瘤组织及正常癌旁组织的LINC00152表达水平。2 MTT分析法检测细胞活力:将瘤细胞在37℃,5%CO2下孵育24小时后,在不同时间点(24,48,72,96小时)向每个孔中加入10μlMTT溶液(5mg/mL);施加150μlDMSO以溶解MTT晶体;然后,通过酶标仪分析570nm处的板的吸光度。3克隆形成实验:将转染的瘤细胞在含有10%FBS的DMEM中于37℃,5%CO 2下培养;每三天更换一次培养基;两周后,将克隆在磷酸盐缓冲盐水中洗涤三次,并用10%甲醛固定半小时;将固定的细胞用PBS中的0.1%结晶紫染色15分钟;手动计算克隆细胞的数量。4 Transwell分析:通过显微镜下Transwell小室下室细胞数计数分析细胞的迁移和侵袭能力。5亚细胞分离:使用细胞质和核RNA纯化试剂盒检测LINC00152在细胞质或细胞核中的定位;然后,利用qRT-PCR检测LINC00152在细胞质和细胞核中的表达水平;GAPDH被认为是细胞质对照,而U6被用作核对照。6双荧光素酶报告分析:构建野生型LINC00152(LINC00152-WT)和突变型LINC00152(LINC00152-MUT);将 pmirGLO-LINC00 152 或 pmirGLO-LINC00 152-MUT与miR-1182模拟物和miR-NC共转染到MG-63或HOS细胞中;48小时后,检测荧光素酶活性。7 RIP实验:在RNA裂解缓冲液中裂解瘤细胞系,细胞裂解物在RNA免疫沉淀缓冲液中培养,随后,用蛋白酶K消化这些样品;分离免疫沉淀的RNA复合物;分光光度计和生物分析仪用于测量RNA的浓度和质量;定量实时PCR检测纯化的RNA。8 Northern印迹分析:分离瘤细胞RNA并纯化,电泳对RNA样品大小分级,将对LINC00152特异的生物素标记寡核苷酸探针与印迹杂交,光密度测定法定量杂交条带的信号强度。9蛋白质印迹分析:检测瘤细胞CDK14表达量。统计分析使用SPSS 18.0分析统计学差异。数据表示为平均值±标准差(SD)。使用t检验和单因素方差分析与图基(Tukey)事后检验分析差异。进行Pearson相关分析以分析LINC00152,miR-1182和CDK14之间的表达关系。每个实验至少进行三次。p值小于 0.05具有统计学差异,p值小于0.01表示显著差异。结果1与邻近的正常组织相比,LINC00152在骨肉瘤组织中过表达,LINC00152的表达水平与肿瘤大小密切相关,具有高LINC00152表达的患者的总体存活率相对低于LINC00152表达低的患者。2与正常成骨细胞系相比,骨肉瘤细胞系LINC00152表达水平显著增高,以MG-63和HOS为著。3通过用sh-LINC00152转染,LINC00152在MG-63和HOS细胞中被下调,MTT法和Traswell实验检测表明,LINC00152的敲低显著抑制了MG-63和HOS细胞系中的细胞增殖、迁移和侵袭。4 TCF3是LINC00152的潜在转录因子,TCF3在OS组织中上调,并且与LINC00152的TCF3正相关。TCF3的过表达显著增加了 MG-63和HOS细胞中TCF3的水平。qRT-PCR和northern印迹分析的结果显示TCF3过表达显著增加了MG-63和HOS细胞中LINC00152的表达水平,结果表明LINC00152在OS 中被TCF3转录激活。5 LINC00152在OS中允当miR-1182的分子海绵,LINC00152通过竞争性结合miR-1182 上调CDK14表达,LINC00152通过调节miR-1182/CDK14轴促进骨肉瘤进展。结论1 LINC00152在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系明显高表达,敲低LINC00152后骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭受到明显抑制。2 LINC00152被TCF3激活,并通过调节miR-1182/CDK14轴在OS中发挥致癌作用,我们的研究结果可能有助于研究新的OS治疗靶点。