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目的在最新的研究中表明,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)在多种类型的恶性肿瘤中过度表达。我们的研究也已经证实,IKBKE在人脑胶质母细胞瘤中高表达,并且与人胶质母细胞瘤的级别呈正相关,沉默IKBKE蛋白质的表达,可以明显抑制人脑神经胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。在本次实验中,我们通过沉默/过表达IKBKE、YAP1及miR-Let-7b/i的表达,来探讨IKBKE通过IKBKE/YAP1/miR-Let-7b/i环路途径调控人脑胶质母细胞瘤的恶性进展的影响。方法我们选取人脑胶质母细胞瘤细胞系U87-MG细胞系和LN-229细胞系用于本实验的研究。首先构建IKBKE shRNA慢病毒。以IKBKE shRNA慢病毒转染U87-MG细胞株及LN-229细胞株,来下调细胞中IKBKE蛋白的表达水平。通过RT-PCR及Western blot方法来检测细胞中IKBKE mRNA及其蛋白水平的表达;通过CCK-8的方法来比较,对照组、无义序列组及沉默IKBKE基因组细胞的增值能力的改变;通过Transwell法检测各组细胞的迁移和侵袭能力的变化;明确沉默IKBKE基因效果后,通过Western blot方法来检测细胞中总YAP1、总p-YAP1(S127)、细胞浆内YAP1、细胞核内YAP1蛋白水平的改变;通过RT-PCR的方法检测沉默IKBKE基因后,YAP1及miR-Let-7b/i mRNA水平的改变;通过免疫荧光实验方法,观察沉默IKBKE基因后,细胞内总YAP1、细胞胞浆及细胞核内YAP1的改变。构建IKBKE过表达质粒,以IKBKE过表达质粒转染细胞,通过RT-PCR及Western blot方法检测IKBKE蛋白及mRNA的过表达水平,及YAP1、miR-Let-7b/i蛋白及mRNA水平的变化。构建YAP1 siRNA,转染细胞,通过Western blot及RT-PCR方法方法检测YAP1蛋白及mRNA表达水平,选取敲低效果最佳的一组,进行下一步实验。明确YAP1敲低效果后,通过Western blot及RT-PCR方法检测IKBKE、miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达水平变化。构建Flag-YAP1过表达质粒,转染沉默IKBKE基因的细胞。通过Western blot及RT-PCR方法,检测YAP1过表达水平,并检测IKBKE、miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达水平变化。构建miR-Let-7b mimics及miR-Let-7i mimics,转染细胞,通过RT-PCR方法检测其过表达水平,Western blot方法分别检测IKBKE、总YAP1、细胞核内YAP1及细胞浆内YAP1蛋白水平改变。结果1.沉默IKBKE基因表达:RT-PCR及Western blot方法表明,人脑胶质瘤U87-MG和LN-229细胞系转染IKBKE shRNA慢病毒后,与对照组、无义序列组细胞比较,转染IKBKE shRNA慢病毒组的IKBKE的蛋白水平及mRNA水平明显降低;CCK-8实验结果显示沉默IKBKE基因后,细胞的增值能力较对照组明显下降,增值曲线差异明显;Transwell实验结果显示,在有Matrigel胶及无Matrigel胶小室内,转染IKBKE shRNA慢病毒组细胞穿过过聚碳酸酯膜的平均数明显减少;Western blot实验方法表明,沉默IKBKE基因后,细胞总YAP1、细胞核内YAP1蛋白水平降低,总p-YAP1(S127)、细胞浆内YAP1蛋白水平升高;免疫荧光实验方法显示,沉默IKBKE基因后,细胞内YAP1总量减少,细胞核内YAP1减少,细胞浆内YAP1增多;RT-PCR结果显示,沉默IKBKE基因后,YAP1 mRNA水平无明显变化,miR-Let-7b及miR-Let-7i水平明显升高。2.过表达IKBKE基因:RT-PCR及Western blot方法表明,细胞系转染IKBKE过表达质粒后,与对照组、无义序列组细胞比较,转染过表达IKBKE质粒组的IKBKE的蛋白水平及mRNA水平明显升高;Western blot实验方法显示,过表达IKBKE基因后,细胞总YAP1蛋白水平升高,总p-YAP1(S127)蛋白水平降低;RT-PCR结果显示,过表达IKBKE基因后,YAP1 mRNA水平无明显变化,miR-Let-7b及miR-Let-7i水平明显降低。3.沉默YAP1基因表达:RT-PCR及Western blot方法表明,细胞转染YAP1siRNA后,与对照组、无义序列组细胞比较,转染YAP1 siRNA组的YAP1的蛋白水平及mRNA水平明显降低;RT-PCR结果显示,沉默YAP1基因后,miR-Let-7b及miR-Let-7i水平明显升高。4.过表达YAP1基因:RT-PCR及Western blot方法表明,沉默IKBKE细胞系转染YAP1过表达质粒后,与对照组、沉默IKBKE组细胞比较,转染过表达YAP1质粒组的YAP1的蛋白水平及mRNA水平明显升高;RT-PCR结果显示,过表达YAP1基因后,miR-Let-7b及miR-Let-7i水平明显降低。5.过表达miR-Let-7b/i:RT-PCR方法表明,细胞转染miR-Let-7b/i mimics后,与对照组、无义序列组细胞比较,转染miR-Let-7b/i mimics组的miR-Let-7b/i mRNA水平明显升高;Western blot实验方法显示,过表达miR-Let-7b/i后,细胞总YAP1、总IKBKE、细胞核内YAP1蛋白水平降低,细胞浆内YAP1蛋白水平升高。结论1.沉默IKBKE基因,能够明显抑制人胶质瘤细胞的增值能力。2.沉默IKBKE基因,能够明显抑制人胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力。3.沉默IKBKE基因,能够降低细胞总YAP1、细胞核内YAP1蛋白水平,升高总p-YAP1(S127)、细胞浆内YAP1蛋白水平;但mRNA水平无明显改变。4.沉默IKBKE基因,能够升高miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达。5.过表达IKBKE基因,能够升高细胞总YAP1蛋白水平,降低总p-YAP1(S127)蛋白水平;但mRNA水平无明显改变。6.过表达IKBKE基因,能够降低miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达。7.沉默YAP1基因,能够升高miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达。8.过表达YAP1基因,能够降低miR-Let-7b及miR-Let-7i的表达。9.过表达miR-Let-7b/i,能够降低细胞总YAP1、总IKBKE、细胞核内YAP1蛋白水平,升高细胞浆内YAP1蛋白水平升高。上述结果可以表明,IKBKE能够通过IKBKE↑→YAP1↑→miR-Let-7b/i↓→IKBKE↑环路途径调控人脑胶质母细胞瘤的恶性进展。