中华蜜蜂核糖体蛋白家族及MAPK信号途径相关基因的生物学特征分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jueduizhi
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昆虫在它们一生中经历了各种各样的形态改变,包括器官的形成、组织的成熟等。在整个发育过程中,机体会受到多种基因的调控。大量研究表明,核糖体蛋白家族和MAPK信号途径中多数基因对生物体的发育起到至关重要的作用。目前关于核糖体蛋白家族基因和MAPK信号途径基因的研究多数集中在拟南芥、人类、大鼠等模式物种,蜜蜂中这两类基因的相关研究很少。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国特有的种质资源,具有重大的经济价值和社会效益。本研究以中华蜜蜂为材料,利用同源序列,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中克隆到三个新基因,分别命名为AccRPL17、AccRPL11和AccTAK1,并对它们进行了序列比对、表达特性分析和功能预测,具体结果如下:(1)氨基酸序列比对发现,AccRPL17、AccRPL11和AccTAK1的氨基酸与其他物种相比同源性分别达到82.07%、83.46%、63.27%,并且具有各自家族保守的功能区域。(2)通过TFSEARCH软件及其数据库预测了三个基因的启动子区域。结果发现,在AccRPL17和AccTAK1都能找到若干与早期组织发育相关的转录因子结合位点,如DRI、CRE、BR-C等;在AccRPL11启动子区域预测到与脑部组织成熟特异性相关的转录因子Croc结合位点。这些结果表明,AccRPL17和AccTAK1基因可能参与早期发育,AccRPL11基因可能与脑部成熟有关。(3)采用qRT-PCR和Northern blot的方法分别对三个基因在中华蜜蜂不同发育时期和组织中的表达特性进行了研究。qRT-PCR结果表明,AccRPL17最高表达量在5日龄幼虫时期,AccTAK1在4日龄幼虫中肠和丝腺组织中表达量高。这些结果表明,AccRPL17可能参与到幼虫早期发育,而AccTAK1可能直接与4日龄幼虫中肠和丝腺的形成有关。Northern blot结果表明,AccRPL11最高表达量在成年蜜蜂脑部,并且其表达量不受性别的影响。这表明AccRPL11可能与成年蜜蜂脑部成熟相关。(4)采用qRT-PCR的方法对三个基因在不同非生物应激中的表达特性进行了研究。结果表明,AccRPL17、AccRPL11、AccTAK1三个基因的转录水平受农药、重金属、有机溶剂等非生物应激的诱导而提高。这些结果一方面表明,这三个基因可能在应激反应过程中起到重要作用,另一方面可间接推测它们在组织发育中的作用。(5)将dsAccRPL11注射入刚出房的成年蜜蜂体内,Northern blot和ELISA结果显示,在注射5天与9天的蜜蜂中AccRPL11的表达量大幅度下降。本研究选择dsAccRPL11注射7天的蜜蜂作为之后研究的对象,并通过qRT-PCR发现dsAccRPL11注射7天的蜜蜂与正常蜜蜂相比,其脑部组织表达量比其他组织下降更明显;半定量PCR结果显示,在dsAccRPL11注射的蜜蜂脑部中,四个与脑部发育相关基因p38、ERK2、CacyBP和CREB,它们的表达量呈现降低趋势。这些结果一方面表明dsAccRPL11注射成功抑制了脑部AccRPL11基因的表达,另一方面暗示了AccRPL11基因与中华蜜蜂成年蜜蜂脑部组织成熟相关。(6)免疫组织化学结果表明,AccRPL17分布在5日龄幼虫的眼部周围组织、肌肉组织、气门及体壁。这些结果表明,AccRPL17在幼虫早期发育中起到一定作用;AccTAK1主要分布在4日龄幼虫的丝腺分泌细胞和中肠肠壁细胞上。这些结果表明,AccTAK1在4日龄幼虫丝腺和中肠形成中起到一定作用;AccRPL11主要分布在正常蜜蜂后脑咽下神经节周围组织、前脑视叶中的髓质和小叶中。然而在注射dsAccRPL117天蜜蜂的脑部,却看不到任何明显的荧光反应。这些结果表明,AccRPL11在成年蜜蜂的脑部成熟中发挥着重要作用。
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