冠心病严重危害人类健康，其传统危险因素包括吸烟、高血压、高血脂、高血糖和肥胖等。新近研究证实血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高也是冠心病一个独立危险因素。高Hcy参与冠心病发病的多个环节，机制十分复杂，其中内皮功能障碍是高Hcy导致冠心病的中心环节。内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间动态平衡的破坏，而内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）在内皮损伤后的修复中起重要作用。EPC是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。研究发现，EPC不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。近来研究表明EPC在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色。Vasa和Hill分别报道冠心病患者循环血中的EPC数量下降了近50％，迁移能力受损，并与危险因子的数目成反向线性关系，而且高危者EPC更易老化。引起冠心病患者EPC数量减少的确切机制尚不明确，可能与患者长期暴露于冠心病的危险因素有关。随后的进一步研究显示糖尿病、高血压、高胆固醇、老龄化及吸烟等冠心病危险因素确实对循环EPC数量和活性具有明显抑制作用。基于上述理论，我们提出假设：高Hcy不但直接损伤血管内皮，可能同时影响EPC的数量和功能，继而影响内皮修复能力，打破内皮损伤和修复之间的动态平衡，导致内皮功能障碍，促发冠心病发生。国内外尚无有关高Hcy对EPC影响的研究报道，我们如能完成这方面的研究，这不但将丰富冠心病的发病理论，同时将为EPC在冠心病防治的临床应用提供理论依据和直接技术保障。为此，我们首先观察了Hcy体外干预对外周血EPC数量和功能的影响，然后进一步观察了高Hcy血症患者外周血EPC数量和功能的变化，最后探讨了Hcy影响EPC的可能机制。以下分三部分对本研究的方法、结果以及结论作一简述。第一部分同型半胱氨酸对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响目的：观察Hcy体外干预对外周血EPC数量和功能的影响。方法：采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养7d后，收集贴壁细胞，加入不同浓度Hcy（10gmol／L，50μmol／L，100μmol／L和200μmol／L）干预24h，观察量效关系。此外，200μmol／LHcy分别干预不用时间（6h，12h，24h和48h），观察时效关系。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC，流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPC，倒置荧光显微镜下计数。采用MTT比色法、改良的Boyden小室、粘附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPC的增殖能力、迁移能力、粘附能力和体外血管生成能力。结果：Hcy显著减少外周血EPC数量，并且EPC数量随Hcy浓度增加及作用时间延长而减少，200μmol／L Hcy作用24h对EPC数量的影响最为显著（35.7±6.7 vs62.5±10.6，P＜0.01）。此外，Hcy可显著损害外周血EPC的粘附能力、迁移能力、增殖能力和体外血管生成能力，且Hcy对EPC这些功能的损害随Hcy浓度增加及作用时间延长而加重，200μmol／L Hcy作用24h对EPC功能的影响最为显著。结论：Hcy可减少EPC数量并损害EPC功能，且Hcy对EPC的影响呈一定的量效和时效关系。第二部分高同型半胱氨酸血症患者循环内皮祖细胞的变化目的：观察高Hcy血症患者外周血EPC数量和功能的变化。方法：入选患者60例，均为本院住院患者，其中高Hcy血症患者组30例，对照组为30例非高Hcy血症患者，两组研究对象的临床资料基本匹配。采用全自动荧光偏振免疫分析法检测血浆Hcy，流式细胞仪计数循环EPC（即AC133⁺KDR⁺细胞）。此外，采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板，培养4d后贴壁细胞进行细胞化学分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC。采用改良的Boyden小室和粘附能力测定实验观察EPC的迁移和粘附能力。结果：高Hcy血症患者循环EPC数量明显减少（63.9±11.7 vs 91.5±14.2 EPCs／mL血，P＜0.01）；并且循环EPC数量与血Hcy水平呈反向线性关系（r=—0.663，P＜0.01）。此外，高Hcy血症患者外周血正在分化的EPC数量也明显减少（36.1±6.5vs51.5±8.3 EPCs／×200视野，P＜0.01）；并且这种EPC的数量与血Hcy水平也呈反向线性关系（r=—0.649，P＜0.01）。进一步研究显示高Hcy血症患者EPC的迁移和粘附能力也明显受损，并且EPC的这两种功能均与血Hcy水平呈反向线性关系。结论：高Hcy血症患者外周血EPC数量减少、功能减退，且EPC的数量和功能与血Hcy水平呈反向线性关系。第三部分同型半胱氨酸影响内皮祖细胞机制的探讨目的：探讨Hcy影响EPC数量和功能的可能机制。方法：采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养4d后，收集贴壁细胞，加入不同浓度Hcy（10μmol／L，30μmol／L，100μmol／L和200μmol／L）干预，或先予以1μmol／L阿托伐他汀预处理1h，然后再用200μmol／L Hcy干预。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC，流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPC。采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞，细胞增殖ELISA试剂盒和集落生成能力测定实验检测EPC的增殖能力和集落形成能力，端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol，TRAP）-ELISA定量检测端粒酶活性，TRAP—聚丙烯酞胺凝胶电泳（PAGE）—银染法定性检测端粒酶活性，Western blot检测EPC Akt Ser⁴⁷³磷酸化水平。结果：Hcy增加SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量，SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量随着Hcy浓度的增加而增加，30μmol／L Hcy即显著增加衰老细胞数量（15.24±9.8 vs29.44±12.3，P＜0.05），200μmol／L Hcy最为显著，较对照增加了2倍（15.2±9.8 vs51.94±13.5，P＜0.01），而阿托伐他汀能显著减少Hcy诱导的衰老细胞的数量。此外，Hcy干预后伴随EPC增殖和集落形成能力的显著损害。随后的研究显示Hcy随着浓度的增加而显著降低EPC端粒酶活性，EPC端粒酶活性定性结果电泳图也显示Hcy干预后条带明显减弱，而阿托伐他汀能减轻Hcy对EPC端粒酶活性的抑制作用。进一步研究发现Hcy显著减少Akt磷酸化，呈一定的量效关系，而阿托伐他汀可预防Hcy对EPC Akt磷酸化的抑制作用。结论：Hcy加速EPC衰老，伴随EPC增殖和集落形成能力的损害。Hcy加速EPC衰老可能跟EPC端粒酶活性下降以及Akt磷酸化水平的下降有关，确切机制有待于进一步研究明确。此外，阿托伐他汀可以预防Hcy对EPC的损害效应。