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背景和目的膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。近年来在我国发病率逐年升高。70~80%膀胱癌患者初次就诊时为非肌浸润性膀胱癌(NMIBC),目前临床上多采用经尿道电切术(TUR)联合膀胱灌注治疗,但治疗后复发率高,且约30%的NMIBC患者术后发展成浸润性膀胱癌。因此,探索其发病机制、寻找有效的治疗靶点,一直是泌尿外科学者研究膀胱癌的重要课题。我们前期研究发现,膀胱癌患者尿液中1-甲基腺苷(m1A)、1-甲基次黄苷(1-mel)、O6-甲基鸟苷(O6-meG)、N4乙酰胞苷(ac4c)4种修饰核苷水平显著高于正常人,其中m1A与1-meI联合检测膀胱癌具有极高的灵敏度(92.45%)及特异度(87.50%),对膀胱癌患者的早期诊断和监测复发具有重要的意义。m1A是由m1A58甲基转移酶催化其tRNA58位的腺苷(A)形成的,该酶由hTrm6p、hTrm61p两个亚基组成,其中hTrm61P由TRMT61A基因编码,是m1A58甲基转移酶的催化亚基。我们后续研究发现膀胱癌组织中hTrm61p mRNA和蛋白表达较癌旁组织中明显升高,下调膀胱癌5637系细胞株中hTrm61p的表达,细胞增殖和侵袭能力显著减弱,凋亡率明显增加,表明hTrm61p可促进膀胱癌的发生、发展,但其表达升高的相关机制尚不明确。如能明确hTrm61p调控的相关机制,必将进一步明确其在该恶性肿瘤防治中的价值。核因子-кB(NF-кB),全称核因子活化B细胞K轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer ofactivated B cells),是一个转录因子蛋白家族,在许多细胞刺激介导的转录调控中起核心作用,参与多种基因的表达和调控,在细胞凋亡和增殖、免疫应答、炎症反应等多种细胞活动中发挥着重要作用。在多种恶性肿瘤中均发现了NF-кB的异常激活,促进活化的NF-кB核移位,参与调控下游靶基因序列,从而促进肿瘤的发生发展。NF-кB在肿瘤中的重要作用使其成为了揭示肿瘤细胞发生发展及其调控的重要环节,经基因库反复对比查询,发现hTrm61p基因启动子区存在NF-кB结合位点,推测NF-кB可能对hTrm61p表达的调控有着重要的影响。此外,二者之间的关系及其具体作用机制目前国内外未有相关报道。本研究旨在前期工作的基础上,进一步检测膀胱癌组织和癌旁组织中hTrm61p和NF-кB的mRNA表达水平,并进行二者的相关性分析;以不同浓度的NF-кB抑制剂PDTC处理5637细胞株,观察细胞的增殖情况,并检测hTrm61p的mRNA和蛋白表达水平;应用免疫荧光方法观察hTrm61p及NF-кB蛋白在5637细胞中的定位;最后采用免疫共沉淀技术检测5637细胞中hTrm61p和NF-кB蛋白的结合情况。通过本课题的研究,可望获得NF-кB在人膀胱癌5637细胞系中对hTrm61p表达调控的直接证据,为进一步探索膀胱癌的发病机制、寻找有效的治疗靶点提供了新的理论依据。方法:1.检测hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌和癌旁组织中的表达:选取郑州大学第一附属医院2016年2月-2017年2月行膀胱全切或膀胱次全切病例34例(其中男27例,女7例,年龄33~81岁,中位年龄62岁,低级别膀胱癌14例,高级别膀胱癌20例),术后活检均确诊膀胱尿路上皮癌,分别取癌组织、癌旁5cm外的正常组织,采用荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌和癌旁组织中的表达,并根据癌组织中hTrm61p及NF-кB mRNA的表达量对二者行相关性分析。2.检测hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌5637细胞及正常人尿路上皮sc-huv-1细胞中的表达:将购自于中科院细胞库的膀胱癌5637系细胞及正常人尿路上皮SV-HUV-1细胞复苏、传代、培养,取生长状况良好的细胞提取RNA,采用RT-qPCR技术检测hTrm61p及NF-кB m RNA的表达水平。3.体外观察NF-кB抑制剂PDTC对膀胱癌5637系细胞增殖能力的影响:实验分4组,空白对照组(不加PDTC处理),低浓度PDTC培养基组(25μmol/L),中浓度PDTC培养基组(50μmol/L),高浓度PDTC培养基组(100μmol/L),培养24h、48h、72h,用CCK-8法检测不同浓度PDTC处理组的5637细胞增殖情况。4.检测NF-кB抑制剂对膀胱癌5637系细胞hTrm61p mRNA及hTrm61p蛋白表达的影响:分别应用RT-qPCR和Western Blot技术检测空白对照组及不同浓度PDTC作用后的5637细胞中hTrm61p mRNA及hTrm61p蛋白的表达。5.观察hTrm61p及NF-кB蛋白在5637细胞中的定位情况:应用双重免疫荧光方法观察hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌细胞5637中的定位。6.采用免疫共沉淀技术检测hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637细胞中的相互作用:使用抗hTrm61p单克隆抗体和抗NF-кB单克隆抗体分别沉淀5637细胞裂解液,以全蛋白组作为对照组,检测5637细胞中hTrm61p和NF-кB蛋白的结合情况。结果:1.膀胱癌组织和癌旁组织中hTrm61p mRNA与NF-кB m RNA表达水平的检测:与癌旁组织相比,hTrm61p mRNA(2.218±0.630)和NF-кB mRNA(2.291±0.729)在癌组织中相对表达水平均明显升高,均具有统计学意义(P<0.01)。采用SPSS 21.0统计软件对癌组织中hTrm61p mRNA及NF-кB mRNA的表达水平进行Pearson相关性分析,结果显示:r=0.834,提示在膀胱癌组织中,hTrm61p mRNA及NF-кB mRNA的表达呈正相关。2.正常尿路上皮SV-HUV-1细胞和膀胱癌5637细胞中hTrm61p mRNA与NF-кB mRNA表达水平的检测:与正常尿路上皮SV-HUV-1细胞相比,膀胱癌5637细胞中hTrm61p mRNA(1.955±0.153)和NF-кB mRNA(2.802±0.048)表达水平明显升高,均具有统计学意义(P<0.01)。3.NF-кB特异性抑制剂PDTC对膀胱癌5637细胞增殖活性的影响:加入不同浓度PDTC培养24h后,CCK-8法检测空白对照组及低、中、高浓度PDTC组OD值分别为0.716±0.036、0.586±0.042、0.475±0.029、0.396±0.033,与对照组相比,PDTC组OD值降低,呈浓度依赖性,有统计学意义(P<0.05);培养48h后,空白对照组、低、中、高浓度PDTC组OD值分别为0.988±0.065、0.701±0.039、0.570±0.035、0.449±0.025,与对照组相比,PDTC组OD值降低,呈浓度依赖性,有统计学意义(P<0.05);培养72h后,空白对照组与低、中、高浓度PDTC组OD值分别为1.127±0.052、0.827±0.012、0.647±0.029、0.499±0.036,与对照组相比,PDTC组OD值降低,呈浓度依赖性,有统计学意义(P<0.05)。说明PDTC可降低膀胱癌5637细胞增殖能力,且呈PDTC浓度依赖性。4.NF-кB抑制剂对膀胱癌5637细胞hTrm61p表达的影响:与未加PDTC的空白对照组相比,25μmol/L PDTC浓度组hTrm61p mRNA的相对表达水平为0.555±0.044,50μmol/L PDTC浓度组hTrm61p m RNA的相对表达水平为0.457±0.011,100μmol/L浓度组hTrm61p m RNA的相对表达水平为0.352±0.034,有统计学意义(P<0.05);与未加PDTC的空白对照组相比,25μmol/L PDTC浓度组hTrm61p蛋白相对表达水平为0.814±0.022,50μmol/L PDTC浓度组hTrm61p相对表达水平为0.641±0.055,100μmol/L PDTC浓度组hTrm61p相对表达水平为0.469±0.036,随着PDTC浓度的增加,hTrm61p蛋白表达水平逐渐降低,呈浓度依赖性,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。5.hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637细胞中的定位情况:hTrm61p蛋白定位于5637胞浆和胞核中,主要定位于胞浆中,NF-кB蛋白亦定位于5637胞浆和胞核中,主要定位于胞浆中;二者共定位信号存在于胞浆和胞核中均存在,主要存在于胞浆中。6.hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637细胞中的免疫共沉淀结果:全蛋白提取组中,同时存在NF-кB p65、hTrm61p蛋白的表达;anti-NF-кB p65进行CO-IP后的上清液中,仅检测到hTrm61p蛋白表达,未检测到NF-кB p65;antiNF-кB p65进行CO-IP后的沉淀复合物中,同时检测到NF-кB p65及hTrm61p的表达;anti-hTrm61p进行CO-IP后的上清液中,仅检测到NF-кB p65表达,未检测到hTrm61p;anti-hTrm61p进行CO-IP后的沉淀复合物中,同时检测到NF-кB p65及hTrm61p的表达。结论:1.hTrm61p mRNA与NF-кB mRNA在膀胱癌患者癌组织及细胞中均明显高表达,二者表达水平呈正相关关系,表明hTrm61p在膀胱癌发生发展中的作用与NF-кB关系密切。2.NF-кB对膀胱癌细胞中hTrm61p的表达有着重要的调控作用,抑制NF-кB活性可抑制hTrm61p的表达,进而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。3.NF-кB与hTrm61p在膀胱癌5637细胞中存在相互作用,为进一步探索膀胱癌的发病机制、寻找有效的治疗靶点提供了新的思路。