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近几十年来,我同矿场资源的消耗速度不断加快,而且通过常规的物理、化学开采法所带来的环境污染非常严重,与当今社会可持续发展的要求背道而驰。在这样的情况下,微生物在生物冶金方面所起的作用越来越受到人们的重视。
嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum,简称L.ferriphilum),是一类嗜酸性专性自养铁氧化细菌,螺旋状,革兰氏阴性菌,有鞭毛,可以运动,最适生长pH2.0,最适生长温度40℃,可以耐受较低的pH值以及较高的氧化还原电位和温度,因此是生物浸矿的优势种群,在微生物采矿中发挥着重要的作用。
但在实际的应用过程中,该菌生长缓慢、细胞得率低以及对砷、汞、银等重金属缺乏抗性。不仅限制了其应用范围,而且也给实验室的研究工作带来许多不便,严重阻碍了生物浸矿的发展,对嗜铁钩端螺旋菌进行遗传改造就成为了一个行之有效的方法,那么对基因组进行序列分析,找出与重金属抗性尤其是砷抗性相关的基因,阐明基凶的表达调控机制则是首要解决的问题。
本实验室对L.ferriphilum进行了全基因组测序,采用生物信息学的方法对基因组进行功能注释,分析了基因和基因产物之间的相互关系,发现L.ferriphilum包含一大一小两个抗砷基因簇。本次的研究重点主要是含有功能基因arsA、arsB、arsC和调节基因arsR和arsD,以及一个磷酸转移系统的大的抗砷基因簇,并且对不同细菌所含的抗砷基因进行了序列相似性分析。
本实验将来自于大肠杆菌Plasmid R773和L.ferriphilum中的抗砷基因与实验室所构建的载体pSDU1和敲除了与结合转移相关的mob位点的载体pSDUl-remob进行连接,以氯霉素基因为报告基因,成功构建了组成型及可调控型的抗砷质粒pSDUl-tac-Arsl、pSDU l-remob-tac-Ars1、pSDUl-tac-Ars2和pSDUl-Ars I-S。将这些抗砷质粒转入大肠杆菌中,并对其在大肠杆菌中的抗砷性能进行了检测,结果表明,新型的高拷贝质粒pSDU l-remob-tac-Arsl具有较高的抗砷能力,其对砷的最大抑制浓度能达到20mmol/L,此外抗砷基因在tac启动子的带动下能获得高效的表达。